程璐 ，時學昆 ，張超 ，姜少燕 ，蔣琪

青島大學 附屬心血管病醫(yī)院 a.老年心血管病科；b.介入科；山東 青島 266000

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）簡稱心衰，是心血管等心臟疾病發(fā)展的終末階段，因心肌梗死、炎癥、血流動力學負荷過重等引起心肌損傷，造成心室重構(gòu)，導致心臟收縮功能異常，使心室泵血及充盈功能下降，無法將靜脈回流的血液排出心臟，并造成動脈血液供應不足，進而引發(fā)心衰[1-3]。miR-146a是近年發(fā)現(xiàn)的一種非編碼的微小RNA（miRNA），據(jù)Fabiola等[4]報道，miR-146a在心衰患者的血管內(nèi)皮細胞中呈高表達狀態(tài)，但miR-146a在心力衰竭中的具體作用機制尚未明確。在此，我們使用miR-146a抑制劑腺病毒轉(zhuǎn)染心力衰竭大鼠，觀察對心力衰竭大鼠的影響，并探討其可能機制。

1 材料和方法

1 材料

8周齡雄性SPF級SD大鼠，體重290～310 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司［許可證號：SCXK（京）2012-0001］。

miR-146a抑制劑腺病毒及陰性對照（未攜帶miR-146a抑制劑腺病毒）購自深圳百恩維生物科技有限公司；HE染液、分化液、返藍液購自Ser?vicebio公司；TUNEL試劑盒購自Roche公司；Taq Man Universal PCR Mix、TaqMan microRNA As?say、Power SYBR green PCR master mix購自大連寶生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Promega公司；Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體購自 Santa Cruz公司；GAP?DH抗體購自廣州瑞博奧生物科技有限公司；BCA試劑盒購自Thermo公司；RIPA裂解液購自碧云天公司；SDS-PAGE電泳液購自上海信裕生物技術(shù)有限公司。

植入型動物起搏器購自上海復旦大學電子工程系；多道生理信號采集處理系統(tǒng)購自成都儀器廠；呼吸機購自成都泰盟科技公司；超聲診斷儀購自西門子公司；脫水機、包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；光學顯微鏡、成像系統(tǒng)購自尼康公司；離心機購自Heraeus公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀/穩(wěn)壓電源購自Bio-rad公司；熒光定量PCR儀購自ABI公司；紫外分光光度計、酶標儀、超低溫冰箱等購自Thermo公司。

1.2 心力衰竭大鼠模型制備

參考文獻[5]建立心力衰竭大鼠模型。大鼠固定于手術(shù)臺，腹部及胸腔手術(shù)部位剃毛并消毒后進行麻醉，常規(guī)無菌操作，腹部正中行3 cm切口，將起搏器固定于腹腔內(nèi)壁上，并逐層縫合腹部切口。將導線引至胸骨左緣第5肋間處，氣管插管并進行機械輔助通氣，于胸骨左緣第5肋間處行開胸術(shù)，暴露心臟后將心包撕開，將導線固定于右心室心尖部，用慶大霉素注射液沖洗胸腔后分層縫合胸腔，待大鼠恢復呼吸后拔出氣管插管并縫合頸部切口。術(shù)后應用7 d抗生素防止感染，常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后7 d以550/min起搏頻率持續(xù)起搏4周，其中6只大鼠不進行起搏處理，觀察大鼠的行為表現(xiàn)及體征。起搏后期大鼠的心率加快、心腔擴大、心臟體積增大、心室壁變薄、心臟重量增加，且活動量減少、毛色干枯、飲食量減少、睡眠增加，判定心力衰竭大鼠造模成功。

1.3 實驗分組

將6只不進行起搏處理的大鼠作為假手術(shù)組（A組），將心力衰竭造模成功的大鼠隨機分為模型組（B組）、miR-146a抑制劑組（C組）、未攜帶miR-146a抑制劑腺病毒組（D組），每組6只。向C組大鼠左心腔內(nèi)注射1×1012μg/mL攜帶miR-146a抑制劑腺病毒200 μL，夾閉主動脈10 s，使病毒經(jīng)冠狀動脈均勻轉(zhuǎn)染至大鼠的心肌組織，其余操作同1.2，詳細步驟參考文獻[6]。D組大鼠注射未攜帶miR-146a抑制劑的腺病毒200 μL。處理7 d后麻醉并處死觀察。

1.4 qRT-PCR測定心力衰竭大鼠心肌中miR-146a表達水平

處死大鼠，取出心臟，用0.9%的氯化鈉注射液清洗后于-80℃冰箱中保存。取左心室心肌組織，滴加TRIzol溶液后進行研磨，待細胞充分裂解后加入氯仿提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，特異性擴增cDNA。miR-146a上游引物為5'-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3'，下游引物為5'-ATCTACTCTCTCCAGGTCCTCA-3'；GAPDH上游引物為5'-GAGGACCAGGTTGTCTCC TG-3'，下游引物為5'-GGATGGAATTGTGAGGGA GA-3'。PCR 反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 min，40 個循環(huán)。用 2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)整理。詳細步驟參考文獻[6]。

1.5 心臟超聲心動圖測定大鼠心功能

停止起搏后用小動物超聲成像系統(tǒng)測定心力衰竭大鼠的左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），取連續(xù)3個心動周期的平均值并記錄。

1.6 HE染色觀察心力衰竭大鼠心肌的病理學改變

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，切片入蘇木精染液染3～5 min，分化液分化，沖洗，返藍液返藍，沖洗，酒精脫水后伊紅染液中染色5 min，無水乙醇脫水，中性樹膠封片后進行圖像采集。細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈紅色。

1.7 TUNEL法測定心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡

采用熒光TUNEL法測定心力衰竭大鼠左心室游離壁的組織心肌細胞凋亡。進行石蠟包埋，用TUNEL試劑盒進行脫蠟、水合，待細胞通透后加入TdT和dUTP，DAPI復染后加入抗熒光淬滅劑，封片。經(jīng)熒光染色后凋亡的細胞在熒光顯微鏡下呈綠色，藍色為正常細胞，每張切片尋找5個視野，記錄其平均值。凋亡率（%）=×凋亡細胞數(shù)/（凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù)）×100%。

1.8 Western印跡檢測心力衰竭大鼠心肌組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9的表達

用含有蛋白酶抑制劑的裂解液將心肌組織于4℃裂解1 h，提取心肌組織總蛋白并測定其濃度，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色后溫室封閉60 min，加入一抗，溫室孵育1 h，回收一抗并用TPBS漂洗，加入二抗，溫室孵育1 h，回收二抗后漂洗，加入ECL發(fā)光試劑檢測，曝光后拍照，用Image J軟件分析。詳細步驟參考文獻[6]。

1.9 統(tǒng)計學檢驗

應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，2組間比較使用獨立t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心力衰竭大鼠心肌組織中miR-146a的表達水平

與A組比較，B組大鼠心肌組織中miR-146a的表達水平明顯上調(diào)（P<0.05）；C組大鼠心肌組織中miR-146a的表達水平明顯較B組下調(diào)（P<0.05）。說明miR-164a在心力衰竭大鼠心肌中呈高表達狀態(tài)，且攜帶miR-164a抑制劑的腺病毒已轉(zhuǎn)染至心力衰竭大鼠的心肌組織（圖1）。

2.2 miR-164a對心力衰竭大鼠大鼠心功能的影響

圖1 心力衰竭大鼠心肌組織miR-146a的表達水平

與A組比較，B、C組大鼠LVEF、LVFS明顯下降（P<0.05）；C組大鼠LVEF、LVFS明顯較B組上升（P<0.05），說明miR-164a抑制劑可明顯改善心力衰竭大鼠的心功能（表1）。

2.3 心力衰竭大鼠心臟病理組織學改變

HE染色結(jié)果顯示，A組大鼠心室前壁心肌細胞排列正常，輪廓清晰，且心肌細胞形態(tài)正常，無明顯病理改變；B組大鼠心室前壁心肌細胞排列雜亂，心肌細胞水腫，周圍有炎性細胞浸潤，甚至出現(xiàn)質(zhì)間充血、心肌纖維排列紊亂等，細胞核出現(xiàn)固縮或碎裂，壞死心肌出現(xiàn)纖維肉芽增生，纖維化程度明顯，與D組相似；C組大鼠心肌纖維排列紊亂程度較輕，細胞形態(tài)明顯較B組好，僅出現(xiàn)少量炎癥細胞浸潤，纖維組織也明顯較B組少（圖2）。

2.4 miR-146a對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，A、B、C、D組大鼠心肌細胞凋亡率分別為2.33%±0.98%、42.37%±6.10%、11.90%±1.90%、40.80%±6.29%，C組心力衰竭大鼠心肌細胞的凋亡率明顯較A組高（P<0.05），較B組低（P<0.05）。說明心力衰竭大鼠心肌細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，而miR-146a抑制劑可抑制心力衰竭大鼠心肌細胞的凋亡（圖3）。

2.5 miR-146a對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達的影響

表1 miR-146a對心力衰竭大鼠大鼠心功能的影響

圖2 心力衰竭大鼠心臟病理組織學改變（HE染色，×100）

Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，C組大鼠心肌細胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白的表達水平明顯較B組下調(diào)（P<0.05），但仍然較A組上調(diào)（P<0.05）。說明心力衰竭大鼠心肌細胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表達明顯上調(diào)，而miR-146a抑制劑能明顯下調(diào)心力衰竭大鼠心肌細胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達。表明抑制miR-146a可抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡。

2.6 miR-146a對心力衰竭大鼠PI3K/Akt信號通路的影響

Western印跡結(jié)果（圖5）顯示，3組大鼠心肌細胞中PI3K、Akt蛋白的表達水平無明顯差異（P>0.05），但C組大鼠PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平明顯較B組高（P<0.05）、較A組低（P<0.05）。說明miR-146a抑制劑可明顯激活PI3K/Akt信號通路。

3 討論

圖3 miR-146a對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

圖4 miR-146a對心力衰竭大鼠Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達的影響

圖5 miR-146a對心力衰竭大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達的影響

心臟收縮及舒張功能異常致使心臟排血無法滿足機體需求，進而引發(fā)患者心力衰竭，是多數(shù)心血管疾病的終末表現(xiàn)，也是心血管疾病致死的主要原因，已逐漸得到醫(yī)學界的重視[7]。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在心力衰竭相關(guān)疾病的發(fā)展中有重要作用[8]。例如，miR-133及miR-30在肥厚心肌中的表達下降，導致調(diào)控纖維化過程的結(jié)締組織生長因子（CTCF）表達升高，促進心肌纖維化[9]；miR-133通過抑制Caspase的表達，發(fā)揮其抑制心肌細胞凋亡的作用[10]；miR-21在缺氧心肌細胞中的表達明顯上調(diào)，與心肌細胞的凋亡及再灌注損傷密切相關(guān)[11]。趙思嘉等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-146a在自身免疫性心肌炎（EAM）大鼠心肌組織中的表達明顯上升，而miR-146a agomirs（拮抗劑）可顯著降低EAM大鼠心臟炎的癥狀，大鼠的心功能也得到明顯改善。但目前關(guān)于miR-146a與心力衰竭的相關(guān)報道較少，本研究初步探索了miR-146a在心力衰竭大鼠心肌細胞中的表達及對心肌細胞的影響，并探討了其可能機制。

冠狀動脈結(jié)扎、心肌毒藥、主動脈瓣撕裂等所致的心衰模型會導致模型動物出現(xiàn)缺血面積過大（或過小）、病死率過高；而右心室快速起搏建立的心力衰竭大鼠模型，病死率較小，且模型動物的血流動力學及病理改變與人類慢性心衰較相似[5]，因此本研究使用右心室快速起搏建立心力衰竭大鼠模型。研究中共建立心力衰竭大鼠26只，其中3只死亡，5只用于解剖驗證心力衰竭大鼠模型心室結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果顯示，心力衰竭模型組大鼠心肌組織中miR-146a呈高表達；心功能明顯下降；心臟出現(xiàn)明顯的病理性改變，心室前壁心肌細胞排列雜亂，有大量炎性細胞浸潤，甚至出現(xiàn)質(zhì)間充血，細胞核固縮或碎裂，纖維化程度明顯；心肌細胞凋亡率增加；凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達明顯增加。表明心力衰竭大鼠模型建立成功。

心力衰竭建模成功的大鼠進行miRNA-146a抑制劑轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miRNA-146a抑制劑的大鼠心肌組織中miR-146a顯著下調(diào)，心功能明顯較模型組好轉(zhuǎn)，心肌纖維排列紊亂程度及細胞形態(tài)明顯較模型組好，僅出現(xiàn)少量炎癥細胞浸潤，纖維組織也明顯較模型組少，心肌細胞凋亡率明顯較模型組下降，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達亦明顯較模型組減少。提示miRNA-146a抑制劑轉(zhuǎn)染成功，且miRNA-146a抑制劑可明顯改善心力衰竭大鼠的心功能及心臟的病理結(jié)構(gòu)，并抑制心肌細胞凋亡。

為了進一步研究心力衰竭大鼠中miRNA-146a的發(fā)病機制，本研究檢測了PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達。Western印跡顯示，PI3K、Akt在假手術(shù)組、模型組及轉(zhuǎn)染miRNA-146a抑制劑大鼠心肌組織中的表達無明顯差異，但是轉(zhuǎn)染miRNA-146a抑制劑大鼠的p-PI3K、p-Akt明顯較模型組高。提示miRNA-146a可能通過抑制PI3K/Akt信號通路促進心力衰竭大鼠心肌細胞的凋亡。因為心力衰竭的主要特征之一就是心肌細胞的凋亡，且該過程受多種凋亡因子調(diào)控，可通過調(diào)控下游多種蛋白，參與細胞的生長、凋亡等過程，而PI3K/Akt是體內(nèi)一條重要的抗凋亡促增殖的信號轉(zhuǎn)導通路[13]。Zhang[14]等研究顯示PI3K/Akt通路在機體受到心肌缺血再灌注損傷時被激活，磷酸化的PI3K、Akt會與下游多個靶點相互作用，抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮對心肌的保護作用，而上調(diào)該信號可明顯減少心肌細胞的凋亡。大量研究[14-16]表明，miRNA可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路影響細胞的增殖與凋亡。

綜上所述，心力衰竭大鼠心肌組織miR-146a表達明顯上調(diào)。miR-146a可能通過激活PI3K/Akt信號通路發(fā)揮其促進心肌細胞凋亡的作用，促進疾病的發(fā)生與進展。