聶思怡 ，王召靜 ，李歡歡 ，徐晨 ，姚文兵

1.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.北京三元基因藥業(yè)股份有限公司，北京102600

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）屬于腺病毒科的哺乳動(dòng)物腺病毒屬，是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，可引起嬰幼兒急性呼吸道感染等多種疾病[1]。腺病毒肺炎（adenoviral pneumonia，AP）是一種主要由3型和7型HAdV（HAdV3、HAdV7）感染引起的較常見的肺炎類型[2]，占兒童肺炎的3%～5%，好發(fā)于6個(gè)月至2歲的兒童，在新生兒、嬰幼兒肺炎中，腺病毒感染率可達(dá)20%左右，病亡率高達(dá)10%[3-4]。然而目前還沒有特異性的治療藥物批準(zhǔn)上市，臨床治療多采用廣譜抗病毒藥物如利巴韋林[5]，但效果不令人滿意。因此，需要尋求更有效的抗HAdV3藥物和治療方案[6]。

重組人干擾素（interferon，IFN）α1b是機(jī)體天然免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可通過誘導(dǎo)一系列抗病毒蛋白表達(dá)以及增強(qiáng)細(xì)胞免疫發(fā)揮廣譜抗病毒作用[7]。在此，我們從不同角度研究IFNα1b體外抗HAdV3的效果，并采用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法[8]觀察IFNα1b與利巴韋林聯(lián)用時(shí)的相互作用關(guān)系，旨在為HAdV3感染的臨床治療方案提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和HAdV3病毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存，病毒經(jīng)A549細(xì)胞擴(kuò)增，待約80%細(xì)胞病變脫落時(shí)，按照Reed-Muench法[9]測定其細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（cell culture infective dose 50%，CCID50）為106.115CCID50/0.1 mL。重組人IFNα1b原液（北京三元基因藥業(yè)股份有限公司，批號(hào) 20190401）；利巴韋林（ribavirin，RBV；純度99.8%，批號(hào)11970）購自MCE公司；胎牛血清（FBS）和RPMI1640粉末購自Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）和二甲亞砜（DMSO）購自Amresco公司；Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit購自Invitrogen公司；完全培養(yǎng)基為含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，細(xì)胞維持液為含2% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。

1.2 藥物對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用

A549細(xì)胞以1×105/mL接種于96孔板，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔和調(diào)零孔，過夜培養(yǎng)；IFNα1b和利巴韋林分別以800 μg/mL和10 mg/mL為起始濃度，用完全培養(yǎng)基按1/4梯度稀釋至所需濃度加入細(xì)胞，各濃度平行6孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；避光條件下，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL）；將96孔板于37℃、5% CO2條件下孵育4 h后棄去孔內(nèi)上清液，加入DMSO（150 μL/孔），振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀檢測各孔的D570nm值，以630 nm為參考波長。細(xì)胞活力（%）=加藥孔D570nm值/細(xì)胞對(duì)照孔D570nm值×100%

1.3 IFNα1b抗HAdV3體外藥效研究

A549細(xì)胞以1.5×105/mL接種于96孔板，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、細(xì)胞對(duì)照孔和病毒對(duì)照孔，過夜培養(yǎng)；用 100 CCID50的 HAdV3感染細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下吸附2 h；IFNα1b以100 μg/mL為起始濃度、用細(xì)胞維持液按1/10梯度稀釋至所需濃度加入細(xì)胞，利巴韋林以1000 μg/mL為起始濃度、1/2梯度稀釋至所需濃度加至細(xì)胞，各濃度平行6孔，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h；IFNα1b組每孔吸取100 μL上清液至新的96孔板中，用Cy?totoxicity LDH Assay Kit-WST試劑盒檢測上清液中的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，按1.2的方法對(duì)IFNα1b組和利巴韋林組細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測。細(xì)胞損傷率（%）=（給藥組D570nm值-細(xì)胞對(duì)照組D570nm值）/（病毒對(duì)照組D570nm值-細(xì)胞對(duì)照組D570nm值）×100%；細(xì)胞存活率（%）=（給藥組D570nm值-病毒對(duì)照組D570nm值）/（細(xì)胞對(duì)照組D570nm值-病毒對(duì)照組D570nm值）×100%。

1.4 IFNα1b對(duì)HAdV3感染A549細(xì)胞凋亡率的影響

A549細(xì)胞以0.6×104/mL接種于24孔板，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔和病毒對(duì)照孔，過夜培養(yǎng)；用100 CCID50的HAdV3感染細(xì)胞，于37℃、5% CO2條件下吸附2 h；IFNα1b以10 μg/mL為起始濃度，用細(xì)胞維持液按1/10梯度稀釋至所需濃度加至細(xì)胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。用Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit試劑盒檢測凋亡細(xì)胞，右上象限（Annexin V+/PI+）顯示晚期凋亡細(xì)胞，右下象限（Annexin V+/PI-）顯示早期凋亡細(xì)胞，左下象限（Annexin V-/PI-）顯示活細(xì)胞，左上象限（Annexin V-/PI+）為操作過程中的機(jī)械損傷細(xì)胞。

1.5 IFNα1b與利巴韋林抗HAdV3聯(lián)合效應(yīng)

細(xì)胞鋪板及病毒感染步驟如1.2，IFNα1b和利巴韋林分別以10 ng/mL和500 μg/mL為起始濃度，用細(xì)胞維持液按1/2梯度稀釋至所需濃度，IFNα1b+利巴韋林聯(lián)合用藥組中2種藥物按1∶1的比例加至細(xì)胞，各濃度平行4孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后按1.2方法進(jìn)行MTT檢測。按照中效方程式fa/fu=（D/Dm）m計(jì)算2種藥物單獨(dú)及聯(lián)合作用時(shí)的中效濃度（Dm）值：取對(duì)數(shù)lg（fa/fu）=mlgD-mlgDm（D為藥物濃度，fa代表藥物作用效應(yīng)即細(xì)胞存活率，fu=1-fa，m為斜率），按照此式計(jì)算達(dá)不同細(xì)胞存活率時(shí)2種藥物單獨(dú)及聯(lián)用所需的濃度，再應(yīng)用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法中量效公式計(jì)算2種藥物在各種效應(yīng)時(shí)的聯(lián)合指數(shù)CI=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2（D1、D2為2種藥物聯(lián)合作用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)各自所需濃度，Dx1、Dx2為2種藥物分別單獨(dú)作用產(chǎn)生x效應(yīng)時(shí)各自所需濃度）。2種藥物聯(lián)用作用機(jī)制相同時(shí)α=1，不同時(shí)α=0；CI<1表示2種藥物具有協(xié)同作用；CI=1表示2種藥物具有相加作用；CI>1表示2種藥物具有拮抗作用，CI越大，拮抗作用越強(qiáng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件分析數(shù)據(jù)并擬合曲線，數(shù)據(jù)以x±s表示，根據(jù)細(xì)胞活力百分比計(jì)算藥物的半數(shù)毒性濃度（50% cytotoxic concentra?tion，CC50），根據(jù)細(xì)胞損傷率和細(xì)胞存活率計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度（50% effective concentration，EC50），治 療 指 數(shù)（therapeutic index，TI）=CC50/EC50。組間差異采用One-way ANOVA分析，Post Hoc檢驗(yàn)選用Dunnett檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用

藥物作用48 h，各IFNα1b加藥組細(xì)胞均未見明顯異常形態(tài)，最高濃度組（800 μg/mL）細(xì)胞存活率為36%；利巴韋林最高濃度組（10 mg/mL）細(xì)胞出現(xiàn)皺縮成串，胞內(nèi)顆粒增多等異常形態(tài)，細(xì)胞存活率為35%（圖1）。IFNα1b和利巴韋林對(duì)A549細(xì)胞的CC50值見表1。

2.2 IFNα1b抗HAdV3體外藥效研究

病毒對(duì)照組細(xì)胞在24 h時(shí)大部分腫脹變圓，48 h時(shí)完全病變，細(xì)胞皺縮脫落；而加藥孔細(xì)胞部分病變，病變程度隨給藥濃度增大而減小。最高劑量的IFNα1b作用效果最好（圖2）。

圖1 IFNα1b和利巴韋林對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用

表1 IFNα1b和利巴韋林抗HAdV3體外藥效比較

圖2 感染HAdV3 48 h時(shí)的A549細(xì)胞形態(tài)（×100）

HAdV3感染2 h后給予不同濃度的IFNα1b處理，48 h后檢測上清中LDH釋放量。結(jié)果表明，IFNα1b作用效果呈劑量依賴性，最高濃度IFNα1b作用下細(xì)胞損傷率為13%（圖3），計(jì)算得EC50為 2.6±0.8 ng/mL，TI>100 000（表 1）。

MTT法測得最高濃度IFNα1b和利巴韋林作用下的細(xì)胞存活率分別為75%和59%（圖4），計(jì)算得 EC50分別為 3.4±0.5 和 215.1±10.0 μg/mL，IFNα1b的TI（>100 000）遠(yuǎn)大于利巴韋林（28.3）（表1），表明IFNα1b對(duì)HAdV-3敏感性強(qiáng)，藥效遠(yuǎn)優(yōu)于利巴韋林。

2.3 IFNα1b對(duì)HAdV3感染A549細(xì)胞凋亡率的影響

HAdV3感染A549細(xì)胞48 h，病毒對(duì)照組中多數(shù)細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段，細(xì)胞凋亡率為80.02%，分別加入0.1、1和10 μg/mL IFNα1b作用病毒感染的細(xì)胞后，其凋亡率分別降至13.47%、10.81%和8.88%（圖5）。

圖3 IFNα1b對(duì)HAdV3感染細(xì)胞損傷的抑制作用

對(duì)各組細(xì)胞的早、晚期凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)（圖6），IFNα1b給藥組（0.1、1、10 μg/mL）細(xì)胞早期凋亡率（3.40%、2.56%、2.46%）與病毒對(duì)照組早期凋亡細(xì)胞率（5.68%）相比無顯著差異（P>0.05）；而晚期細(xì)胞凋亡率分別降為86.45%、88.90%、91.36%，與病毒對(duì)照組晚期凋亡細(xì)胞率相比具有極顯著差異（P<0.001）。

2.4 IFNα1b與利巴韋林抗HAdV3聯(lián)合效應(yīng)

與利巴韋林單藥組相比，聯(lián)合給藥組對(duì)感染細(xì)胞的保護(hù)作用更加顯著（P<0.05），不同濃度利巴韋林與IFNα1b聯(lián)用時(shí)的細(xì)胞存活率分別為利巴韋林單用時(shí)的2.715、3.543、2.553、1.544、1.297倍（表2）。IFNα1b和利巴韋林單用時(shí)的Dm分別為0.00349和481.41463 μg/mL，聯(lián)用時(shí)為83.63996 μg/mL。聯(lián)用時(shí)其中IFNα1b為0.00167 μg/mL，與單用時(shí)相比降低了52.01%；利巴韋林為83.63828 μg/mL，與單用時(shí)相比降低了82.63%。

圖4 IFNα1b、利巴韋林對(duì)HAdV3感染細(xì)胞存活率的影響

圖5 AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測散點(diǎn)圖

表2 IFNα1b和利巴韋林聯(lián)用抗HAdV3體外藥效研究（x±s，n=4）

通過Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法計(jì)算存活率fa為0.1～0.9時(shí)的聯(lián)用指數(shù)CI，評(píng)價(jià)IFNα1b和利巴韋林的相互作用關(guān)系，結(jié)果如圖7，CI隨fa增大而增大，說明協(xié)同作用逐漸減弱，拮抗作用逐漸增強(qiáng)。IFNα1b（0.000625～0.005 μg/mL）與利巴韋林（31.25～250 μg/mL）在該濃度范圍內(nèi)按 1∶1聯(lián)用時(shí)，兩者呈協(xié)同作用（CI<1）；而IFNα1b（0.01 μg/mL）與利巴韋林（500 μg/mL）按1∶1聯(lián)用時(shí)，兩者協(xié)同作用不明顯（CI=1.03）。

圖6 IFNα1b對(duì)HAdV3感染細(xì)胞凋亡率的影響***P<0.001

3 討論

根據(jù)生物學(xué)和免疫學(xué)特性，人腺病毒可劃分為A～G共7個(gè)亞群，超70種血清型[10]。不同型別的腺病毒組織嗜性不同，引起的臨床表現(xiàn)不同[11]，其中B亞群中的3、7型主要引起呼吸道疾病[12]，如腺病毒肺炎（adenovirus pneumonia，AP）。AP重癥比例、病死率和后遺癥發(fā)生率顯著高于其他類型的肺炎，大約1/3可發(fā)展為重癥肺炎[13]；免疫功能不全人群感染HAdV并引起重癥肺炎時(shí)發(fā)生急性呼吸衰竭的機(jī)率為10%～30%，病死率高出普通人群50%，兒童呼吸道持續(xù)感染腺病毒可導(dǎo)致閉塞性細(xì)支氣管炎、氣管炎和肺氣腫并繼發(fā)細(xì)菌性氣管炎、支氣管擴(kuò)張，且超過半數(shù)重癥患兒留有反復(fù)咳嗽、喘等肺功能不全后遺癥，少數(shù)甚至發(fā)展為肺心病，造成終生殘疾[14]。

圖7 IFNα1b與利巴韋林聯(lián)用的CI-fa曲線

重組人干擾素α1b為我國具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的第一個(gè)基因工程Ⅰ類新藥[15]，通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種抗病毒蛋白和激活細(xì)胞免疫等多種機(jī)制發(fā)揮廣譜抗病毒作用，對(duì)呼吸道合胞病毒、腸道病毒等常見病毒均有抑制作用[16-17]，臨床用于多種兒童常見病毒性疾病的治療[18]。此外，重組人干擾素α1b還在抗擊新型冠狀病毒感染中發(fā)揮了重要作用[19]。為系統(tǒng)研究IFNα1b抗HAdV3體外藥效，我們從細(xì)胞水平不同角度探討了IFNα1b抗HAdV3的效果。結(jié)果表明IFNα1b具有一定的HAdV3抑制作用，可降低病毒所致細(xì)胞的損傷率和死亡率，從不同角度驗(yàn)證了IFNα1b對(duì)HAdV3感染細(xì)胞的保護(hù)作用，其治療指數(shù)TI>100 000，遠(yuǎn)大于利巴韋林，說明IFNα1b抗HAdV3的作用強(qiáng)，安全性高，應(yīng)用價(jià)值大。

多種病毒可根據(jù)自身增殖周期精密調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡，Ouerido等[20]發(fā)現(xiàn)腺病毒早期轉(zhuǎn)錄單位E1A基因表達(dá)產(chǎn)物可促使抑癌蛋白P53聚集并使其半衰期延長，使抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)減少，促凋亡基因Bax表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞快速凋亡，而E1B蛋白則保護(hù)病毒感染的細(xì)胞免于凋亡。在感染早期，病毒以各種方式有效抑制宿主細(xì)胞凋亡，為自身提供復(fù)制環(huán)境并免受免疫系統(tǒng)的破壞；而在感染晚期，病毒通過促進(jìn)宿主細(xì)胞的凋亡以釋放子代病毒粒子，加速感染進(jìn)程。因此，調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡對(duì)病毒侵染機(jī)體至關(guān)重要。臨床研究表明[21]，病毒性肺炎患兒急性期和恢復(fù)期外周血中性粒細(xì)胞早期凋亡率和淋巴細(xì)胞早晚期凋亡率均顯著升高；急性期與恢復(fù)期比較發(fā)現(xiàn)僅淋巴細(xì)胞晚期凋亡率顯著下降，其余無明顯差異，提示細(xì)胞亞群早晚期凋亡率可作為臨床判斷病毒性肺炎的依據(jù)以及區(qū)分疾病發(fā)展階段的指征。在病毒調(diào)控細(xì)胞凋亡的同時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)也在發(fā)揮作用以制約病毒，α干擾素作為一種抗病毒細(xì)胞因子，可通過改變PKR、2′-5′寡腺苷酸合成酶等抗病毒蛋白基因和Bcl-2、caspase酶等凋亡相關(guān)蛋白基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡[22]。因此，本研究進(jìn)一步分析了IFNα1b對(duì)HAdV3感染細(xì)胞凋亡的影響，顯示IFNα1b的干預(yù)作用主要表現(xiàn)為對(duì)晚期凋亡細(xì)胞的抑制，提示IFNα1b可能通過抑制HAdV3促凋亡蛋白或增加感染細(xì)胞本身抑凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，使子代病毒粒子釋放受阻，干擾病毒增殖。

利巴韋林是一種合成的嘌呤核苷類似物，通過抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶活性來干擾病毒DNA的復(fù)制，其消除半衰期較長[23]，是目前臨床用于治療兒童AP的常用廣譜抗病毒藥物，但藥物在細(xì)胞中大量蓄積易導(dǎo)致過敏反應(yīng)、溶血性貧血等不良反應(yīng)[24]。為尋求療效更好、不良反應(yīng)發(fā)生率更低的治療方案，本研究嘗試將利巴韋林與IFNα1b聯(lián)用，結(jié)果表明聯(lián)用組細(xì)胞存活率顯著高于相應(yīng)濃度的利巴韋林單藥組，兩藥采用較低濃度時(shí)即可達(dá)到單藥高濃度時(shí)的抑制效果。聯(lián)合效應(yīng)研究結(jié)果表明，IFNα1b與利巴韋林在一定濃度范圍內(nèi)聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同作用。Morrow等[25]通過檢測水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis vi?rus，VSV）感染的A549細(xì)胞中IFN信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，利巴韋林和IFNα2a聯(lián)用可使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）1和 2、IFN 調(diào)控因子（IFN regulatory factors，IRF）9和 IFN 激活基因（IFN stimulated gene，ISG）15的表達(dá)增加，同時(shí)上調(diào)STAT1和STAT2的磷酸化水平。提示利巴韋林可能通過增強(qiáng)JAK-STAT信號(hào)途徑傳導(dǎo)和應(yīng)答基因的表達(dá)從而發(fā)揮與α干擾素協(xié)同抗病毒的作用。

本研究提示小劑量聯(lián)合IFNα1b和利巴韋林對(duì)HAdV3有更好的抑制作用，可降低單藥的藥物劑量，減少毒副作用，為臨床治療HAdV3提供了理論和初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但在復(fù)雜的人體環(huán)境中，病毒感染的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是病毒本身的生物學(xué)特性和機(jī)體免疫系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。體外研究并不能完全展現(xiàn)人體在病毒侵染時(shí)所發(fā)生的變化。另外,藥物的聯(lián)用效果受多種因素制約，涉及藥效動(dòng)力學(xué)的受體效應(yīng)，藥代動(dòng)力學(xué)中的吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化、代謝等一系列問題，其療效和作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究來加以驗(yàn)證。