侯江厚 ，張靈霞 ，黃國紅 ，詹曉燕 ，楊奕梅

1.昆明市婦幼保健院，云南 昆明 650013；2.解放軍總醫(yī)院 第八醫(yī)學中心，北京 100091

新型冠狀病毒?。–OVID-19）是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的一種傳染性極高的呼吸系統(tǒng)性疾病，自2019年12月出現以來，該病在全球范圍內迅速蔓延。重癥COVID-19患者可導致多器官損傷和衰竭，最終死亡[1]。目前，針對COVID-19的治療還沒有特效藥物，病毒的傳染源、中間宿主以及潛伏期等諸多因素的不明確也將導致本次新冠疫情的防控面臨巨大的壓力和挑戰(zhàn)，因此，研發(fā)高效的抗病毒藥物是對抗SARS-CoV-2感染的關鍵。SARS-CoV-2的基因圖譜、蛋白結構和入侵受體等生物學相關機制都相繼被快速探明，為抗病毒藥物的研發(fā)奠定了基礎[2]。SARS-CoV-2表面的刺突（spike，S）蛋白是病毒打開宿主細胞大門的“鑰匙”，S蛋白通過與宿主細胞表面的血管緊張素轉換酶2（angioten?sin converting enzyme 2，ACE2）受體結合，介導SARS-CoV-2感染的第一步[3]。自然狀態(tài)下S蛋白以一種相對穩(wěn)定的同源三聚體形式存在，當S蛋白與ACE2結合時，S蛋白三聚體與ACE2二聚體之間有多個基團相互作用，促進細胞內吞而增強病毒入侵過程。S蛋白由S1和S2兩部分組成，其中S1組成棘突的頭部，受體結合域（receptor binding domain，RBD）位于S1區(qū)域表面，其受體結合基序（receptor binding motif，RBM）僅有數個氨基酸[4]。阻斷病毒和宿主細胞受體的結合可以阻止病毒入侵，是抗病毒藥物研發(fā)策略之一，阻斷S蛋白RBD是阻止SARS-CoV-2感染的關鍵，是抗COVID-19藥物研發(fā)的重要靶點。抗體或小分子化合物通過與S蛋白RBD靶向結合，抑制或阻斷RBD與ACE2的結合，從而抑制SARS-CoV-2進入宿主細胞，避免宿主細胞感染[5]。

為了獲得RBD完整肽段，我們利用原核表達系統(tǒng)，采用基因重組方法獲得重組RBD肽。蛋白的天然構象是保持該蛋白天然活性的前提，結構中二硫鍵的正確配對往往代表著蛋白正確的空間折疊方式。為了獲得具有天然構象的RBD肽并提高重組蛋白的表達量，我們采用與DsbC蛋白融合表達的方式，充分利用DsbC分子伴侶和二硫鍵異構酶的作用[6]。同時，為了得到沒有冗余氨基酸的RBD肽，以便在后續(xù)抗體制備、配基篩選及抗病毒藥物篩選時能夠提高特異性，在其氨基酸序列的N端引入腸激酶位點，通過原核重組表達并采用腸激酶酶切和二次純化的方法獲得高純度的RBD肽。本研究獲得的RBD肽位于S蛋白Gly319～Asn541，全長223個氨基酸殘基。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）及其感受態(tài)細胞、原核表達載體pET-DsbC由本室制備保存；全基因與引物合成、測序由北京華大基因公司完成；PCR試劑購自上海生工生物有限公司；質粒提取、膠回收等常規(guī)分子生物學實驗試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；蛋白質相對分子質量marker購自北京索萊寶生物公司；重組腸激酶由本室表達純化；Ni-Sepharose chelating Sepharose Fast Flow親和樹脂填料購自中原合聚生物科技公司，本室裝填純化柱；LB培養(yǎng)基、PBS緩沖液配制試劑等其他試劑為進口或國產分析純產品。

1.2 全基因與引物合成

參照GenBank登錄號（MN908947.3）對SARSCoV-2的S蛋白氨基酸序列進行分析，其RBD氨基酸為Gly319～Asn541。為了獲得沒有冗余氨基酸的RBD，保持此肽段正確的空間折疊和生物活性，選定此區(qū)域肽段，同時在N端加入腸激酶序列DDDDK。融合蛋白對應的核酸序列按照利于原核表達系統(tǒng)表達的原則進行優(yōu)化和全基因合成，在對應的核酸兩端分別加入限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ位點序列，3'端加入大腸桿菌終止密碼子taa。

1.3 pET-DsbC-RBD表達載體的構建與鑒定

用限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ雙酶切全基因合成的克隆載體pUC-RBD，紫外燈下切下RBD核酸片段并進行膠回收，對表達載體pET-DsbC同樣以HindⅢ和XhoⅠ進行雙酶切和膠回收，16℃條件下采用T4DNA連接酶對核酸片段和酶切后的載體進行混合連接過夜，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），鋪含卡那霉素的固體平板，次日挑選克隆進行菌落PCR，篩選陽性克隆，PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，判斷產物大小。對陽性克隆擴大培養(yǎng)并測序，測序正確的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DsbC-RBD融合蛋白的原核重組表達與初步純化

取測序正確的陽性工程菌株于37℃振蕩過夜培養(yǎng)進行活化，隔日按1∶100的比例轉接至含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，檢測細菌生長密度，菌液D600nm值約為0.4時加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L），30℃振蕩誘導10 h，6000 r/min離心5 min收集菌體，加入1×PBS充分混勻，在冰水狀態(tài)下超聲波破碎菌體，12 000 r/min離心30 min，分別取上清和沉淀進行12%的SDSPAGE，分析重組DsbC-RBD的表達形式。

取超聲波破碎后的離心上清，以1 mL/min的速度結合鎳離子螯合的親和層析柱，PBS緩沖液緩慢平衡層析柱5個柱體積至基線處于水平狀態(tài)，以50 mmol/L咪唑除去菌體自身雜蛋白，150 mmol/L咪唑洗脫收集目的蛋白，收集2次的洗脫液加入變性緩沖液，煮沸10 min，12% SDS-PAGE分析重組DsbC-RBD的純度。純化后的重組蛋白以水充分透析，凍干保存。

1.5 重組DsbC-RBD融合蛋白的腸激酶酶切

取凍干后的DsbC-RBD粉末，用PBS稀釋至1 mg/mL，加入腸激酶，比例為 1∶3000，充分混勻。為了最大限度地保持RBD肽的生物活性，選擇酶切溫度為4℃，酶切時間為隔夜10 h，酶切后取混合樣品進行15% SDS-PAGE分析酶切效率、酶切特異性和目的蛋白RBD的相對分子質量。

1.6 目的RBD肽的二次親和純化

分子伴侶蛋白DsbC和腸激酶的N端均帶有6×His標簽，通過親和柱層析除去酶切后的DsbC蛋白和腸激酶，采用鎳離子螯合的親和層析方法對酶切后的RBD肽混合液進行分離提純。取酶切后融合蛋白混合液，以1 mL/min的速度重復結合鎳離子螯合的親和層析柱3次，小心收集穿過液，取穿過液，15% SDS-PAGE分析純化后RBD肽的純度和相對分子質量，計算目的蛋白RBD肽酶切后的純化得率，對純化后的RBD肽充分水透析后，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果

2.1 SARS-CoV-2 S蛋白RBD全基因合成

參考GeneBank公布的SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列，選擇Gly319～Asn541序列，根據有利于原核系統(tǒng)表達的原則，采用氨基酸密碼子同義置換，對RBD肽段對應的核酸進行全基因合成，在該肽段的N端加腸激酶序列DDDDK。合成的序列全長包含699個核苷酸，序列如下：

2.2 重組pET-DsbC-RBD表達載體的構建與鑒定

用內切酶HindⅢ和XhoⅠ雙酶切合成載體pUC-RBD，將酶切的RBD核酸片段克隆到表達載體pET-DsbC上，轉化大腸桿菌BL21（DE3），鋪固體平板，以合成的鑒定引物采用菌落PCR方法篩選陽性克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1，在預期的約700 bp處有單一條帶，經測序與合成序列完全一致。

2.3 DsbC-RBD融合蛋白的原核表達及親和純化

取測序正確的工程菌株擴大培養(yǎng)，30℃條件下隔夜誘導，取誘導后的菌體超聲波破碎，高速離心30 min后，取上清和沉淀進行12%的SDS-PAGE，結果如圖2。融合蛋白的相對分子質量為58×103，和預期一致，表達量占菌體總蛋白的30%以上，分別存在于超聲波裂解后的上清和沉淀中。由于可溶性表達往往代表蛋白正確的折疊方式，RBD上清存在形式保證結構區(qū)的空間構象，保證后期抑制劑篩選的特異性。

取超聲波裂解后的上清，以緩慢的速度流經His標簽親和層析柱，再用PBS緩沖液平衡到基線水平，分別用50 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白、150 mmol/L咪唑洗脫收集目的蛋白，12% SDS-PAGE結果如圖3。經親和層析后，DsbC-RBD融合蛋白純度在90%以上，純化后的融合蛋白經水透析，凍干保存。

2.4 DsbC-RBD重組融合蛋白的腸激酶酶切

圖1 RBD核酸片段菌落PCR凝膠電泳鑒定結果

圖2 DsbC-RBD原核表達產物表達形式分析

圖3 DsbC-RBD融合蛋白親和純化電泳分析

充分考慮酶切后RBD肽段的生物功能，避免較高溫度對RBD肽段生物活性的影響，腸激酶酶切只在4℃條件下進行，酶切時間設為8 h。取酶切后混合樣品以15% SDS-PAGE分析，結果如圖4，此條件下酶切效率為100%，沒有產生非特異酶切現象，酶切后顯示RBD肽相對分子質量約為25×103，與理論值一致。

2.5 重組RBD肽的純化

采用鎳離子螯合親和層析對酶切后蛋白混合液中的RBD肽進行分離提純，腸激酶酶切后蛋白混合液以緩慢的速度反復結合親和層析柱，收集流穿液以15% SDS-PAGE鑒定回收RBD肽的純度，結果如圖5，純化后的RBD肽相對分子質量約為25×103，同預期一致，經考馬斯亮藍染色鑒定，純度大于92%，計算得率為30%，得率較低。

3 討論

圖4 DsbC-RBD融合蛋白腸激酶酶切電泳分析

圖5 RBD肽親和純化電泳分析

阻斷病毒和宿主細胞受體的結合可以阻止病毒入侵，是抗病毒藥物研發(fā)策略之一，包括靶向病毒或宿主細胞的受體。SARS-CoV-2具有傳染性極強和潛伏時間長短不一的特點，同時，病毒真正的傳染源及中間宿主也未明確，病毒存在變異風險等，都導致SARS-CoV-2疫情防控具有諸多不確定因素，因此研發(fā)SARS-CoV-2預防和治療性疫苗或高效抗病毒藥物迫在眉睫。目前COVID-19仍沒有特異治療方法和抗病毒治療藥物，MARS-CoV的動物模型研究和COVID-19疫情中康復病人血清的救治均顯示，阻斷入侵策略對冠狀病毒可能有效，S蛋白RBD的阻斷是阻止SARS-CoV-2感染的關鍵，是抗COVID-19藥物研發(fā)的重要靶點。SARS-CoV-2的S蛋白是一種糖蛋白，有3個RBD，內部有二硫鍵連接，在β冠狀病毒屬中保守[7]。RBD結構靠近cryo-EM三聚體的中央部位，使S蛋白形成易于和宿主受體ACE2結合的空間構象，SARS-CoV-2與受體ACE2的結合能力比SARS-CoV更強，更具傳染性[8]。RBD是誘導抗體產生，阻斷病毒結合，刺激宿主免疫反應、中和抗體及保護免疫系統(tǒng)免受病毒感染的主要抗原成分?？贵w或小分子化合物通過與S蛋白RBD的靶向結合，抑制或阻斷RBD結合功能，可特異性阻斷RBD與ACE2的結合，從而抑制SARS-CoV-2進入宿主細胞，避免宿主細胞感染。

目前已有商品化的RBD肽，但價格較昂貴，同時大都采用與人Fc蛋白融合表達，主要用于抗原抗體血清學檢測，而高純度的RBD肽是后續(xù)抗體制備、配基篩選和藥物篩選驗證的基礎和保證。為了獲得高純度的重組RBD肽，我們根據原核系統(tǒng)的特點對氨基酸的密碼子組成進行了同義置換，以利于原核系統(tǒng)的表達；原核系統(tǒng)內的高表達是后續(xù)純化獲得高純度重組蛋白的基礎，采用融合表達方式，兼并考慮RBD肽存在的二硫鍵，在RBD的N端加入同時具有伴侶蛋白和二硫鍵異構酶作用的DsbC蛋白進行融合表達，使得融合蛋白的表達量達到總蛋白的30%以上，并獲得了部分可溶性表達，提示獲得的RBD肽可能具有天然空間結構和正確的二硫鍵配對；其次，在RBD肽的N端加入腸激酶切點，在目前已經很成熟的腸激酶酶切工藝下，通過二次純化獲得了重組RBD肽，該重組RBD肽不含冗余氨基酸，具有結構完整性，在抗體制備和抗病毒藥物篩選時將具有較強的特異性。本方法獲得的RBD肽純度為92%，水溶性較好，但得率較低。高純度的RBD肽為隨后開展以RBD肽為靶標進行相關抑制劑篩選和機制研究提供了可靠的保證，也為臨床以RBD肽為重組抗原進行血清學抗體診斷提供了原料。