劉曉清 譚涵宇 彭俊 秦惠鈺 田野 陳梅 吳權(quán)龍 彭清華

〔摘要〕 目的 觀察散血明目片對兔外傷性增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy， PVR）模型中增殖信號通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、P38MAPK、MEK表達(dá)的影響，探討散血明目片對兔外傷性PVR的防治作用。方法 實(shí)驗(yàn)以42只新西蘭大白兔為對象，采用鞏膜穿通法聯(lián)合向玻璃體腔注射富含血小板血漿形成PVR模型，隨機(jī)分為7組，每組6只，分別為：A組空白組、B組模型組、C組散血明目片組、D組PD98059組、E組LY294002組、F組MK-2206組、G組抑制劑混合組。造模后30 min，D組、E組、F組、G組分別向玻璃體腔注射0.1 mL的PD98059、LY294002、MK-2206及3種混合抑制劑。B、C組則予以玻璃體腔內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水。術(shù)后第1天C組予以散血明目片10 mg/kg溶液灌胃，除A組外其余組以生理鹽水10 mL/kg灌胃，連續(xù)灌胃28 d。28 d后采用B超觀察術(shù)眼玻璃體、眼底情況;取材后采用免疫組化法、RT-qPCR法對送檢組織進(jìn)行相關(guān)蛋白表達(dá)的測定。結(jié)果 B超結(jié)果顯示散血明目片能抑制兔PVR中視網(wǎng)膜的增殖，維持視網(wǎng)膜正常形態(tài)。免疫組化與RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，散血明目片能有效降低兔視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK的表達(dá)，其中以下調(diào)PI3K、Akt、P38MAPK的表達(dá)更顯著。結(jié)論 散血明目片可抑制PVR的發(fā)生與發(fā)展，降低視網(wǎng)膜及增殖膜中相關(guān)增殖蛋白的表達(dá)，其防治PVR方面可能與MAPK、PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變;散血明目片;絲裂原活化蛋白激酶;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B

〔中圖分類號〕R276.7 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.001

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Sanxue Mingmu Tablets on the expression of proliferation signal pathway related proteins PI3K， AKT， P38MAPK and MEK in a traumatic proliferative vitreoretinopathy （PVR） model of rabbits， and to explore the effects of Sanxue Mingmu Tablets in preventing and treating proliferative vitreoretinopathy. Methods For the experiment， 42 New Zealand white rabbits were used as subjects， and the scleral penetration method was combined with the injection of platelet-rich plasma into the vitreous cavity to establish a PVR model. They were randomly divided into 7 groups， with 6 rabbits in each group. They were group A： blank group; group B： model group; group C： Sanxue Mingmu Tablets group; group D： PD98059 group; group E： LY294002 group; group F： MK-2206 group; group G： inhibitor mixed group. In 30 minutes after modeling， 0.1 mL of PD98059， LY294002， MK-2206 and 3 kinds of mixed inhibitors were injected into the vitreous cavity to group D， group E， group F and group G， respectively. In group B and C， 0.1 mL of normal saline was injected into the vitreous cavity. On the first day after operation， the group C was administered with 10 mg/kg solution of Sanxue Mingmu Tablets by gavage. The other groups were intragastrically administered with 10 mL/kg normal saline for 28 days. After 28 days， the vitreous and fundus conditions were observed with B-ultrasound; After the samples were taken， immunohistochemistry and RT-qPCR were used to determine the protein expression of the submitted tissues. Results B-ultrasound showed that Sanxue Mingmu Tablets could inhibit the retina proliferation in rabbit PVR and maintain normal retinal shape. Immunohistochemistry and RT-qPCR showed that Sanxue Mingmu Tablets could effectively reduce the expression of PI3K， AKT， MEK， P38MAPK in the retina and proliferating membrane of rabbits， but the down-regulation of PI3K， Akt， P38MAPK was more significant. Conclusion Sanxue Mingmu Tablets can inhibit the occurrence and development of PVR and reduce the expression of related proliferative proteins in the retina and proliferating membrane. The prevention and treatment of PVR may be related to the MAPK and PI3K/Akt signaling pathways.

〔Keywords〕 ?proliferative vitreoretinopathy; Sanxue Mingmu Tablets; MAPK; PI3K/Akt

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy， PVR）多由眼外傷、大面積視網(wǎng)膜脫離、較大裂孔、玻璃體積血等引起視網(wǎng)膜缺血、炎癥、細(xì)胞增殖，造成玻璃體腔、視網(wǎng)膜前、下及表面形成纖維增生膜并易形成收縮，造成局部牽拉為特征的眼科疾病。PVR為多種玻璃體視網(wǎng)膜疾病的病理基礎(chǔ)和表現(xiàn)，具有病程長、易復(fù)發(fā)性。一旦形成，治療上頗為棘手，往往需要多次手術(shù)且術(shù)后視力恢復(fù)較差，嚴(yán)重易成盲[1]。

中醫(yī)藥防治PVR具有一定的潛力，根據(jù)疾病特點(diǎn)可歸屬于“暴盲”“視瞻昏渺”范疇。由于外力損傷或氣機(jī)阻滯或痰濕上犯所致，導(dǎo)致氣血運(yùn)行不通，形成瘀血、痰飲于眼內(nèi)，日久成膜黏附于視衣及神膏之內(nèi)，堅(jiān)固難移，所謂“癥積”。散血明目片具有活血利水、散結(jié)明目功效，是用于防治玻璃體積血以及PVR的中醫(yī)藥復(fù)方。前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明散血明目片能夠有效維持視網(wǎng)膜正常形態(tài)，并有效減少炎癥細(xì)胞、炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制增生組織及新生血管的形成[2-5]。

國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases， ?PI3K）/蛋白激酶B（protein-serine-threonine kinase， Akt）信號通路在PVR發(fā)生過程中有效被激活，參與了相關(guān)細(xì)胞的增殖、遷移與凋亡。本實(shí)驗(yàn)以外傷性PVR兔模型為研究對象，進(jìn)一步探討散血明目片對PVR中MAPK、PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔44只（湖南太平生物科技有限公司，合格證號：43608300000675），體質(zhì)量1 500～2 000 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行常規(guī)檢查，排除全身疾患，均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室溫度維持在18～26 ℃，濕度在55%左右，每日常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 ?藥物

散血明目片：由三七、酒大黃、澤瀉、豬苓等藥組成，規(guī)格為0.3 g/片，100片/瓶。購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，藥物為同一批次（20171228）。實(shí)驗(yàn)員在規(guī)范無菌操作下對藥片碾碎至粉末狀，并密封至干燥藥罐內(nèi)，存于實(shí)驗(yàn)房消毒柜中。妥布霉素滴眼液（批號：18J02CA，比利時(shí)s.a.ALCON-COUVRUR）、典必殊眼膏（批號：9GBH1A，比利時(shí)s.a.ALCON-COUVRUR）、美多麗滴眼藥（批號：MP2080，參天制藥株式會社）、杰奇凝膠（批號：20180212，湖北遠(yuǎn)大天天明制藥有限公司）、生理鹽水（批號：B18020302d，湖南康源制藥有限公司）等，均購自湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院，所購藥物為同一批次;均放于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心消毒柜中保存。

1.3 ?試劑

LY294002（貨號：S1105，品牌：Selleck， PI3K蛋白抑制劑）、PD98059（貨號：S1177，品牌：Selleck，MEK蛋白抑制劑）、MK-2206抑制劑（貨號：S1078，品牌：Selleck，Akt抑制劑），RIPA蛋白裂解液（CWBIO，CW2334S），ECL發(fā)光檢測試劑盒（貨號：35055，品牌：Thermo Fisher），HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（貨號：SA00001-1，品牌：PROTEINTECH）HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（貨號：SA00001-2，品牌：PROTEINTECH），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：A3500，品牌：Promega）等。

1.4 ?器材

精密分析天平（瑞士Mettler公司，AE240）;顯微手術(shù)器械（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)五官科實(shí)驗(yàn)室提供）;眼部B超機(jī)（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科提供）;超微量分光光度計(jì)（德國IMPLEN公司）;生物組織攤片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)組織與胚胎實(shí)驗(yàn)室提供）;KD-BMⅡ電腦生物組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 ?動(dòng)物分組

采用隨機(jī)分組法將其中42只新西蘭兔。分為7組，每組6只（雌雄各半），A組：空白組（正常組）;B組：模型組;C組：散血明目片組;D組：PD98059組;E組：LY294002組;F組：MK-2206組;G組：抑制劑混合組。

2.2 ?富含血小板血漿制備

余2只新西蘭大白兔，25%烏拉坦進(jìn)行腹腔注射，劑量4 mL/kg。麻醉滿意后，剔除腹部兔毛，常規(guī)消毒鋪巾，切開腹部皮膚約10 cm左右，分離筋膜及肌肉，充分暴露腹腔。鈍性分離兔腹主動(dòng)脈后，用采血針頭刺入主動(dòng)脈另一頭連接真空采血管。共抽取腹主動(dòng)脈血50 mL，用TDZ4-WS臺式低速離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，吸出上層血清后中間即為富含血小板血漿（platelet-richplasma， PRP），收集后置于無菌恒溫?fù)u擺箱備用[6]。

2.3 ?模型建立及給藥

參考實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)方法[6]，本次所有實(shí)驗(yàn)兔均采取右眼為實(shí)驗(yàn)眼，充分散瞳全麻后，進(jìn)行常規(guī)消毒鋪巾。開瞼器充分暴露眼球，進(jìn)行眼部局麻。從3點(diǎn)至9點(diǎn)方向分離球結(jié)膜和筋膜，用鞏膜穿刺刀在角膜緣后3 mm處刺向玻璃體中心部，操作時(shí)勿刺傷屈光間質(zhì)和視網(wǎng)膜，用顯微鞏膜剪將切口至兩側(cè)擴(kuò)大，傷口達(dá)6 mm。輕壓兔眼球，將脫出的玻璃體剪除，用8-0可吸收縫合線縫合切口后向玻璃體腔中央注入0.1 mL的PRP。造模后30 min，D-G組分別予以玻璃腔注射0.1 mL的PD98059、LY294002、MK-2206及3種混合抑制劑;B、C組則予以玻璃體腔內(nèi)注射0.1 mL 0.9%Nacl溶液。術(shù)后予以妥布霉素眼膏涂于結(jié)膜囊內(nèi)。造模后1周內(nèi)，予以妥布霉素滴眼液滴眼，3次/d，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴右眼，3次/d。術(shù)后第1天開始，C組予以散血明目片10 mg/kg溶液灌胃，其余組除A組外以生理鹽水10 mL/kg灌胃，均灌胃4周。

2.4 ?指標(biāo)檢測

2.4.1 ?眼部B超檢查 ?造模用藥后第28天進(jìn)行術(shù)眼的B超檢查，觀察玻璃體及眼底情況。

2.4.2 ?免疫組化法檢測視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK蛋白表達(dá)情況 ?將眼球標(biāo)本固定、切片、脫蠟、水化后，按照SP法免疫組化檢測系統(tǒng)進(jìn)行操作。在玻片上作分組標(biāo)記，防置高倍鏡下觀察視網(wǎng)膜增殖膜組織中蛋白PI3K、MEK、Akt的表達(dá)情況，并隨機(jī)選取視野，用圖像分析儀進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2.4.3 ?RT-qPCR法檢測各組視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK mRNA的表達(dá) ?從標(biāo)本中提取RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，qPCR引物進(jìn)行real-time PCR，檢測組織中目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)、超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度與純度、第一鏈cDNA合成、RT-qPCR檢測最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用于PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列見表1。

2.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)以“x±s”表示。多組比較，若滿足正態(tài)性和方差齊性，采用方差分析，不滿足則采用秩和檢驗(yàn)。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?造模并用藥28 d后各組眼部B超結(jié)果

A組：兔眼球?qū)ΨQ，大小正常;晶狀體顯示清晰，大小位置正常，回聲好;球壁光滑，回聲均勻。所有造模組中眼球大小正常，晶狀體無異常，球壁回聲均欠均勻，玻璃體腔內(nèi)與視網(wǎng)膜組織中均可見不同程度的增殖跡象。B組：玻璃體腔內(nèi)可見高回聲光帶與視網(wǎng)膜廣泛粘連，光帶厚度不均。C組：玻璃體腔內(nèi)有細(xì)小線狀回聲。D組：玻璃體腔內(nèi)小片膜狀與視網(wǎng)膜部分粘連。E組：玻璃體腔內(nèi)有大片狀膜狀回聲，部分與視網(wǎng)膜粘連。F組：玻璃體腔內(nèi)靠近視網(wǎng)膜可見小片狀高回聲膜狀物與視網(wǎng)膜粘連。G組：玻璃體腔稍見點(diǎn)狀高回聲，視網(wǎng)膜表面見細(xì)小膜狀回聲光帶。見圖1。

3.2 ?免疫組化法檢測各組視網(wǎng)膜及增殖膜組織中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK表達(dá)情況

與A組比較，B-G組各蛋白表達(dá)量均升高（P<0.05或P<0.01）。與B組比較，C-G組各蛋白表達(dá)量，除Akt蛋白表達(dá)中D組與B組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），余均有意義（P<0.05或P<0.01）。與C組比較，在PI3K蛋白表達(dá)上：D-F組表達(dá)量均高于C組（P<0.05或P<0.01），G組表達(dá)量與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;Akt蛋白表達(dá)上：D、E組表達(dá)量均高于C組（P<0.01），F(xiàn)、G組表達(dá)量接近C組，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;MEK蛋白表達(dá)上：E、F組表達(dá)量均高于C組（P<0.01），D、G組表達(dá)量均低于C組（P<0.05）;P38MAPK蛋白表達(dá)上：D-G組表達(dá)量與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見圖2-5和表2。

3.3 ?RT-qPCR檢測各組視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK mRNA的表達(dá)情況

造模后，各蛋白均在組織中呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)：與A組比較，B-G組各蛋白表達(dá)量均升高（P<0.05或P<0.01），其中PI3K和Akt蛋白表達(dá)中G組與A組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與B組比較，C-G組各蛋白表達(dá)量均降低（P<0.05或P<0.01）。與C組比較，PI3K蛋白表達(dá)中：D-F組表達(dá)量均高于C組（P<0.05或P<0.01），G組與C組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;Akt蛋白表達(dá)中：D-F組表達(dá)量均高于C組（P<0.01），G組與C組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;MEK蛋白表達(dá)中：D、G組表達(dá)量均低于C組（P<0.05），E、F組表達(dá)量高于C組（P<0.01）;P38MAPK蛋白表達(dá)中：D-G組表達(dá)量均高于C組（P<0.05或P<0.01）。見表3。

4 討論

目前，PVR的臨床治療主要以手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高以及視力的提升率低成為了治療瓶頸。研究顯示從最初的癥狀到增殖膜形成造成視網(wǎng)膜脫離的時(shí)間需要1～2月，因此，開發(fā)有效的新藥阻止和治療PVR前期藥物的工作緊迫[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PVR是細(xì)胞高增殖與低凋亡的病理過程，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為攻破該疾病的一大入口[7]。MAPK作為信號傳導(dǎo)酶在多種細(xì)胞功能中起著關(guān)鍵作用，包括誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、趨化因子表達(dá)和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。而P38MAPK則是其中的關(guān)鍵部分，與PVR的發(fā)生關(guān)系密切，調(diào)控了細(xì)胞的增殖與遷移[8-10]。Saika等[11]利用P38MAPK抑制劑和dominant negative（DN）p38MAPK研究了TGF-p38MAPK通路對RPE細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果也表明TGF-p38MAPK通路與RPE細(xì)胞遷移密切相關(guān)，證明MAPK通路參與了EGF刺激下的RPE細(xì)胞遷移和增生。MAPK通路有三級的信號傳遞過程：MAPK、MAPK激酶（MEK或MKK）以及MAPK激酶的激酶（MEKK或MKKK）。最具特征的MAPK信號通路是RAS-RAF-MEK-ERK信號通路，受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)的受體和部分細(xì)胞因子受體均可激活該信號通路，但外界刺激RAS被激活是信號聯(lián)級的第一步，RAS介導(dǎo)激活RAF后會反過來激活雙功能激酶MEK，可以使絲/蘇氨酸和酪氨酸發(fā)生磷酸化，最終高度選擇性地激活ERK1和ERK2[12]。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶激活PAR-1可通過RAS激活RAF-MEK-ERK1/2信號通路而誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的增殖[13]。

PI3K是由P85調(diào)節(jié)亞基與P110催化亞基組成，在細(xì)胞存活途徑、基因表達(dá)和細(xì)胞代謝調(diào)控、細(xì)胞骨架重排等方面發(fā)揮了重要作用。而Akt則是PI3K信號產(chǎn)生的重要靶點(diǎn)，Akt磷酸化多個(gè)參與細(xì)胞周期控制的蛋白質(zhì)，最終刺激細(xì)胞的生長[14]。CAI N等[15]通過收集PVR患者視網(wǎng)膜進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號通路在PVR視網(wǎng)膜色素上皮中高度激活。通過信號通路抑制劑RAPA和LY294002可通過降低mTOR信號元件的磷酸化水平而抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的進(jìn)程并促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，從而阻滯了PVR的發(fā)展。陳海婷等發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過P38MAPK和PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)RPE細(xì)胞周期阻滯和凋亡，對PVR的防控起到了一定的作用[16]。

散血明目片是在中醫(yī)眼科活血利水法理論指導(dǎo)下的治療PVR臨床經(jīng)驗(yàn)方，由三七、酒大黃、蒲黃、益母草、防己、地龍、白茅根、豬苓、澤瀉、山楂等中藥組成?？v觀全方，以功效為止血化瘀的三七和蒲黃為君藥，使眼部血癥得以控制以及消散停于神膏內(nèi)、視衣上的“瘀血”，兩藥均歸屬肝經(jīng)。以利水滲濕藥豬苓與澤瀉為臣藥，利水滲濕而化濁，將眼珠內(nèi)“痰飲”及時(shí)排出，兩藥歸屬腎、膀胱經(jīng)。方中酒大黃，上清上焦血分熱毒，以消雙目之血瘀水結(jié)之癥;蒲黃，性甘、平，止血化瘀，利水通淋;益母草，活血清熱，利水消腫，均為佐藥，歸屬肝經(jīng)。白茅根、地龍、防己性寒，涼血止血而利尿，均歸屬肺、膀胱經(jīng)，亦為佐藥。山楂性溫，行氣散瘀而化濁為使藥，歸脾、胃、肝經(jīng)，調(diào)和寒性藥物而不傷胃，加強(qiáng)行氣散瘀之功。全方共奏活血通脈、利水散結(jié)之功，使瘀血去、痰飲消，行氣通脈而使雙目明。

在本次實(shí)驗(yàn)研究中，B超結(jié)果顯示造模后28 d各造模組在視網(wǎng)膜及玻璃體出現(xiàn)不同程度的增殖，在散血明目片組中未見有大片的膜狀高回聲，有效地抑制了增殖膜的形成，從而避免引起局部收縮形成瘢痕褶皺造成視網(wǎng)膜脫離的嚴(yán)重并發(fā)癥。免疫組化法檢測視網(wǎng)膜組織PI3K、Akt、MEK、P38MAPK蛋白表達(dá)中，各蛋白表達(dá)量均有所下降，以及蛋白表達(dá)多在視神經(jīng)纖維層以及節(jié)細(xì)胞層。RT-qPCR檢測增殖膜上各蛋白表達(dá)情況顯示：散血明目片均可減少PI3K、Akt、MEK、P38MAPK蛋白在增殖膜上的表達(dá)，其中以下調(diào)PI3K、Akt、P38MAPK蛋白顯著，對MEK蛋白調(diào)控不顯著。

本研究提示MAPK及PI3K/Akt信號通路至少部分參與了兔PVR生成的可能性，可能進(jìn)一步揭示散血明目片防控PVR的機(jī)制，并為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

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