何小偉，陳雪菊，石世代，劉勇帆

吉安市中心人民醫(yī)院普外科，江西 吉安 343000

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在不同國家、地區(qū)、種族中的發(fā)病率均有所不同。膽囊癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，導(dǎo)致患者一經(jīng)確診，常處于晚期，預(yù)后極差[1-4]。因此探討膽囊癌的發(fā)病機(jī)制對于膽囊癌的治療具有重要意義。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（interferon induced transmembrane protein 3，IFITM3）基因是IFITM家族的一員，位于人染色體11p5.5，堿基長度約為1.5 kb，編碼蛋白分子量約為14 kD，由133個(gè)氨基酸組成。IFITM3基因的5'啟動(dòng)子區(qū)域/增強(qiáng)子區(qū)域含有干擾素刺激反應(yīng)原件，會(huì)被干擾素所誘導(dǎo)繼而編碼跨膜蛋白，參與病毒感染、原始生殖細(xì)胞遷移、內(nèi)胚層定位等[5-7]。近些年來研究還發(fā)現(xiàn)IFITM3在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，如在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤中均過表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5,8-10]。但I(xiàn)FITM3在膽囊癌中的作用尚未見報(bào)道，因此本研究將構(gòu)建IFITM3過表達(dá)載體，探討IFITM3過表達(dá)對膽囊癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人膽囊癌細(xì)胞MHCC97H購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

pCDNA3.1（+）、質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生物科技有限公司；Trizon Reagent、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；OPTI-MEM?Ⅰ購自美國Gbico公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM3000脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司。MF53倒置顯微鏡購自廣州市明美光電有限公司；RT-6000酶標(biāo)分析儀購自美國Rayto公司；UV-1600PC紫外可見分光光度計(jì)購自上海美譜達(dá)儀器有限公司；CFX ConnectTM實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 IFITM3過表達(dá)載體的建立

查找IFITM3基因序列，引入酶切位點(diǎn)（XbaⅠ/XhoⅠ）生物合成基因片段[克隆至pcDNA3.1（+）載體上]。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，小提質(zhì)粒，37℃，酶切2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，將IFITM3-pcDNA3.1菌種以1∶100的比例接種于50 ml LB肉湯液體培養(yǎng)基（含有100 μg/ml氨芐西林）中，過夜培養(yǎng)，大提質(zhì)粒并酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IFITM3、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2associated X protein，BAX）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）mRNA 的表達(dá)

收集細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA純度[光密度值（optical density，OD）260/OD280=1.6～1.8，說明RNA純度良好]，將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，70℃10 min，再迅速冰浴2 min，50℃15 min，85℃5 min，最后實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，操作體系：RNase Free ddH2O 9.5 μl，模板 1 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，2×ULtra-SYBR Mixture 12.5 μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性 95 ℃10 min，變性 95 ℃ 10 s，退火 57.5 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環(huán) 30 次。擴(kuò)增結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)-△Ct對照，△Ct實(shí)驗(yàn)=Ct目的-Ct內(nèi)參，△Ct對照=Ct目的-Ct內(nèi)參。目的基因引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.5 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

125 μl opti-MEM+5 μl LipofectamineTM3000 混勻，將125 μl opti-MEM+≥2.5 μgIFITM3-pcDNA3.1質(zhì)粒（過表達(dá)組）或pcDNA3.1空白質(zhì)粒（過表達(dá)對照組）+5 μl LipofectamineTM3000混勻，將兩種混合物混勻，加入到6孔板中，此時(shí)膽囊癌細(xì)胞MHCC97H生長融合度達(dá)到70%，轉(zhuǎn)染6 h，棄掉轉(zhuǎn)染液，換上新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染效果。同時(shí)設(shè)立不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的空白對照為正常對照組。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將膽囊癌細(xì)胞MHCC97H接種到96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%的時(shí)候，按1.5方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h，加入CCK-8試劑孵育4 h，于酶標(biāo)儀波長560 nm處測OD值，OD值即代表細(xì)胞活力。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測細(xì)胞遷移能力

將膽囊癌細(xì)胞MHCC97H接種到24孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%的時(shí)候，用10 μl的槍頭在每個(gè)孔進(jìn)行劃線，線與培養(yǎng)板底部細(xì)線垂直，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，加入新鮮培養(yǎng)基，后立即給每個(gè)孔的劃痕拍照，記為0 h，接著按1.5方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h后，再次給每個(gè)孔的劃痕拍照，記為24 h，最后按照0 h與24 h相對應(yīng)的劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞的遷移速率。

1.8 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力

將Matrigel膠平鋪于Transwell小室上，備用。將膽囊癌細(xì)胞MHCC97H單細(xì)胞懸液接種到Transwell上室，并按照1.5方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h，而下室不接種細(xì)胞，僅加入新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，將小室取出，多聚甲醛固定下室細(xì)胞10 min，結(jié)晶紫染色10 min，最后在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒IFITM3-pcDNA3.1酶切后的電泳圖譜

質(zhì)粒IFITM3-pcDNA3.1經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ酶切后，理論上應(yīng)有1254 bp和5428 bp的條帶，電泳檢測結(jié)果與理論值都相符，證明IFITM3-pcDNA3.1為正確質(zhì)粒。（圖1）

圖1 質(zhì)粒IFITM3-pcDNA3.1酶切后的電泳圖譜

2.2 質(zhì)粒IFITM3-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染效果

IFITM3-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞48 h后，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測后，結(jié)果顯示，與正常對照組（1.000±0.000）及過表達(dá)對照組（0.989±0.065）比較，過表達(dá)組（4.385±0.553）IFITM3mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)（F=222.471，P＜0.01）。

2.3 IFITM3過表達(dá)對MHCC97 細(xì)胞活力的影響

IFITM3-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞12、24、48、72 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h時(shí)，過表達(dá)組細(xì)胞OD值分別明顯高于正常對照組及過表達(dá)對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48、72 h時(shí)活力相當(dāng)。（表2）

2.4 IFITM3過表達(dá)對MHCC97 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

IFITM3-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞24 h后，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞遷移速率明顯高于正常對照組及過表達(dá)對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。IFITM3-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞48 h后，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯多于正常對照組及過表達(dá)對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖2、圖3、表3）

2.5 IFITM3過表達(dá)對MHCC97細(xì)胞中BAX、Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平的影響

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測3組MHCC97H 細(xì)胞的遷移能力（×200）

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測3組MHCC97H 細(xì)胞的侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

IFITM3-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞48 h后，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組中BAXmRNA表達(dá)水平明顯低于正常對照組及過表達(dá)對照組，Bcl-2mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組及過表達(dá)對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表4）

3 討論

IFITM3最初是于1984年在神經(jīng)母細(xì)胞瘤干擾素治療的cDNA文庫篩選中獲得的，除了能夠表達(dá)于細(xì)胞膜上，還能夠以顆粒樣的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。IFITM3基因位于人染色體11p5.5，堿基長度約為1.5 kb，編碼蛋白分子量約為14 kD，由133個(gè)氨基酸組成。IFITM3基因的5'啟動(dòng)子區(qū)域/增強(qiáng)子區(qū)域含有干擾素刺激反應(yīng)原件，會(huì)被干擾素所誘導(dǎo)繼而編碼跨膜蛋白，因此IFITM3在不同的細(xì)胞中發(fā)揮著不同作用，不僅能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性，還能夠參與生殖細(xì)胞的成熟與歸巢，另外IFITM3還與IFITM1、IFITM2起協(xié)同作用，共同參與流感病毒、登革熱等多種病毒的感染[5-8]。近些年來研究還發(fā)現(xiàn)IFITM3在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，如IFITM3在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤中均過表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-10]。Hu等[11]研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)IFITM3在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平均顯著高于正常對照，同時(shí)IFITM3的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。敲除IFITM3能顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，而且能夠使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，此過程與WNT/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。Zhang等[12]研究顯示IFITM3表達(dá)于人肺腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)中，并與腫瘤惡性程度密切相關(guān)，敲除IFITM3能顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。Yang等[13]研究結(jié)果顯示，IFITM3shRNA能顯著下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中IFITM3表達(dá)，降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞生長與克隆，并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。以上研究說明IFITM3的表達(dá)與胃癌細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，因此本研究構(gòu)建IFITM3過表達(dá)載體，探討IFITM3過表達(dá)對膽囊癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)MHCC97H細(xì)胞OD值的比較（±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)MHCC97H細(xì)胞OD值的比較（±s）

注：a與正常對照組比較，P＜0.01；b與過表達(dá)對照組比較，P＜0.01

組別正常對照組過表達(dá)對照組過表達(dá)組F值P值0 h 0.336±0.042 0.336±0.025 0.336±0.070 0.000＞0.05 12 h 0.429±0.044 0.419±0.032 0.434±0.045a b 15.591＜0.01 24 h 0.574±0.033 0.563±0.054 0.720±0.056a b 19.141＜0.01 48 h 1.133±0.051 1.173±0.088 1.395±0.059a b 25.905＜0.01 72 h 1.142±0.118 1.158±0.057 1.389±0.034a b 79.384＜0.01

表3 3組MHCC97H細(xì)胞遷移速率及侵襲數(shù)目的比較（±s）

表3 3組MHCC97H細(xì)胞遷移速率及侵襲數(shù)目的比較（±s）

注：a與正常對照組比較，P＜0.01；b與過表達(dá)對照組比較，P＜0.01

組別正常對照組過表達(dá)對照組過表達(dá)組F值P值8.8 0±0.8 0 9.2 6±0.8 0 1 3.4 3±1.6 0 a b 3 0.4 9 8＜0.0 1 1 2 8±1 3 1 3 2±1 2 1 9 8±1 5 a b 5 1.7 0 3＜0.0 1遷移速率（μ m/h）侵襲數(shù)目

表4 3組MHCC97H細(xì)胞中BAX、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

表4 3組MHCC97H細(xì)胞中BAX、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與正常對照組比較，P＜0.01；b與過表達(dá)對照組比較，P＜0.01

組別正常對照組過表達(dá)對照組過表達(dá)組1.0 0 0±0.0 0 0 0.9 8 0±0.1 8 6 0.6 3 4±0.0 0 2 a b 1.0 0 0±0.0 0 0 1.0 2 7±0.0 7 5 2.0 0 9±0.0 4 1 a b F值P值B A X m R N A 2 2.0 2 9＜0.0 1 B c l-2 m R N A 8 1 7.5 9 2＜0.0 1

本研究首先構(gòu)建了IFITM3-pcDNA3.1過表達(dá)載體，并通過酶切后電泳，證實(shí)所構(gòu)建載體成功。接著將IFITM3過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞MHCC97H，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。本研究探討IFITM3過表達(dá)對MHCC97H膽囊癌細(xì)胞活力的影響，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)，MHCC97H細(xì)胞活力提高，其中48、72 h細(xì)胞活力相當(dāng)。進(jìn)一步劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFITM3過表達(dá)能顯著加快MHCC97H細(xì)胞遷移速率，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IFITM3過表達(dá)能顯著增加MHCC97H細(xì)胞侵襲能力，從而說明過表達(dá)IFITM3能顯著促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。抑制凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白BAX是Bcl-2家族最為常見的凋亡蛋白，二者能夠形成異源二聚體，傳遞凋亡信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[14-15]。所以本研究進(jìn)一步探討IFITM3過表達(dá)對MHCC97H膽囊癌細(xì)胞中Bcl-2、BAXmRNA表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)IFITM3過表達(dá)能顯著上調(diào)Bcl-2mRNA表達(dá)，下調(diào)BAXmRNA表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了IFITM3-pcDNA3.1過表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染MHCC97H膽囊癌細(xì)胞，還證實(shí)了IFITM3過表達(dá)能顯著促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，同時(shí)還能調(diào)控Bcl-2及BAX表達(dá)，說明IFITM3可能成為膽囊癌基因治療的新靶點(diǎn)。