成世高，王萬(wàn)春，蔣棟，李騰飛，李洵，任煉，肖炯哲，康鵬程

1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科，長(zhǎng)沙 410011

2婁底市中心醫(yī)院骨科，湖南 婁底 417000

骨肉瘤是一種罕見的惡性間葉細(xì)胞腫瘤，具有 高度侵犯性和轉(zhuǎn)移性，即使利用手術(shù)切除結(jié)合化學(xué)治療，對(duì)已有轉(zhuǎn)移的病患治療后的效果并不理想[1]，目前，對(duì)于骨肉瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍未研究清楚[2]。因此，識(shí)別和驗(yàn)證有效的腫瘤特異性標(biāo)志物用于骨肉瘤早期診斷對(duì)提高臨床療效，制訂個(gè)性化治療方案有重要臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）是影響骨肉瘤發(fā)展的重要因子，相關(guān)miRNA表達(dá)情況能夠在一定程度上決定骨肉瘤患者的疾病發(fā)展[3]。miRNA是一段長(zhǎng)約22～24個(gè)核苷酸的單鏈RNA。有學(xué)者預(yù)測(cè)，人類超過(guò)30%的基因受到miRNA調(diào)控[4-5]。當(dāng)細(xì)胞的生長(zhǎng)失去控制或不再具有細(xì)胞凋亡的功能時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，近年來(lái)關(guān)于miRNA與腫瘤的研究中，重點(diǎn)多在于miRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡的調(diào)控。miRNA-30家族由5種高度同源的成員組成，即miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d 和 miRNA-30e，miRNA-30家族成員在多種腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[6-7]。miRNA-30家族成員在不同腫瘤中的作用各不相同，甚至相互沖突，其在腫瘤起始和進(jìn)展中既發(fā)揮抑癌基因又發(fā)揮原癌基因的作用。miRNA-30在乳腺癌[6]、卵巢癌[8]、膀胱癌[9]、肝癌[10]、黑色素瘤[11]和皮膚鱗狀細(xì)胞癌[12]中發(fā)揮抑癌基因的作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30家族成員在乳腺癌[13]、前列腺癌[14]、肝癌[15]等多種腫瘤中發(fā)揮原癌基因作用。miRNA-30家族在不同實(shí)體瘤中的作用不同甚至相反，表明miRNA-30在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有多種不同作用，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。目前，關(guān)于miRNA-30家族在骨肉瘤中表達(dá)意義的研究較為少見，本研究首先采用熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測(cè)5種miRNA-30家族成員在骨肉瘤及相應(yīng)正常成骨組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步采用原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR篩選的在骨肉瘤和正常成骨組織中表達(dá)有差異的miRNA-30家族成員的表達(dá)情況，分析這些miRNA與骨肉瘤患者臨床特征的關(guān)系，旨在為骨肉瘤的診治提供新的靶點(diǎn)和思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2017年12月中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院收治的骨肉瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)外科手術(shù)后標(biāo)本送檢由臨床病理科診斷確診。依據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入36例骨肉瘤患者，男21例，女15例，年齡6～34歲，平均年齡為（17.2±3.4）歲；失訪4例，隨訪資料完整32例，隨訪時(shí)間5～50個(gè)月，平均隨訪時(shí)間（47.1±3.4）個(gè)月；Enneking外科分期：ⅡA期5例，ⅡB期27例；腫瘤部位：股骨9例，脛腓骨14例，其他部位（包括肱骨、頜骨等）9例；分化程度：中高分化17例，低分化15例；肺轉(zhuǎn)移12例，復(fù)發(fā)11例。取32例骨肉瘤組織和32例正常骨組織標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RT-PCR法檢測(cè)miRNA-30家族成員的相對(duì)表達(dá)量 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，提取骨肉瘤組織的總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)miRNA-30家族成員 miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d和miRNA-30e在骨肉瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量。以U6為內(nèi)參，設(shè)計(jì)miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c和miRNA-30d和miRNA-30e的引物（表1），引物設(shè)計(jì)完成后，BLAST分析引物序列合理性，最后送至深圳華大基因合成。以cDNA為模板，采用鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為mRNA，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.2 原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的表達(dá)情況 組織芯片脫蠟，于37℃蛋白酶消化15 min，漂洗后梯度乙醇脫水。55℃預(yù)雜交30 min后，地高辛標(biāo)記的miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e探針（100 nmol/L）恒溫雜交1 h，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗地高辛抗體室溫孵育1 h，NBT/BCIP黑暗處30℃顯色，核固紅復(fù)染。雜交過(guò)程選擇U6探針（1 nmol/L）作為陽(yáng)性對(duì)照，去除探針作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，U6主要定位于細(xì)胞核，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分，無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)計(jì)為0分，中等強(qiáng)度或強(qiáng)表達(dá)計(jì)為1分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜10%計(jì)為0分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≥10%計(jì)為1分；將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘，0分表示表達(dá)陰性，1分表示表達(dá)陽(yáng)性。所有的操作流程及相關(guān)的試劑均根據(jù)相關(guān)的說(shuō)明書進(jìn)行，請(qǐng)兩名副高職稱的病理醫(yī)師進(jìn)行盲閱。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；miRNA-30家族成員表達(dá)與骨肉瘤患者臨床特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)分析；骨肉瘤患者預(yù)后的影響因素采用Cox回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-30家族成員相對(duì)表達(dá)量的比較

骨肉瘤組織中 miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常骨組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而骨肉瘤組織中miRNA-30b和miRNA-30d的相對(duì)表達(dá)量與正常骨組織比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 骨肉瘤患者骨肉瘤組織和正常骨組織中miRNA-30家族成員相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2 骨肉瘤組織中miRNA-30家族成員陽(yáng)性表達(dá)率的比較

原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e三種探針在骨肉瘤組織中均顯示為藍(lán)色的陰性顆粒；而在正常成骨組織中，顯示為棕色顆?；蛘邎F(tuán)塊（圖1）。骨肉瘤組織中 miRNA-30a、miRNA-30c和 miRNA-30e的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于正常骨組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。

圖1 原位雜交檢測(cè)骨肉瘤患者骨肉瘤組織和正常骨組織中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的表達(dá)情況（1%甲基綠染色，×200）

表3 骨肉瘤患者骨肉瘤組織和正常骨組織中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.3 不同臨床特征骨肉瘤患者骨肉瘤組織miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e陽(yáng)性表達(dá)情況

不同性別、腫瘤部位和分化程度骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30a陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同Enneking外科分期、肺轉(zhuǎn)移情況和復(fù)發(fā)情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30a陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.182、19.269、28.303，P＜0.05）。不同性別、腫瘤部位、分化程度、肺轉(zhuǎn)移情況和復(fù)發(fā)情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30c陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同Enneking外科分期骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30c陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.293，P＜0.05）。不同性別、腫瘤部位、分化程度、Enneking外科分期和復(fù)發(fā)情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30e陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同肺轉(zhuǎn)移情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30e陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.172，P＜0.05）。（表4）

表4 不同臨床特征骨肉瘤患者骨肉瘤組織miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e陽(yáng)性表達(dá)情況（n=32）

2.4 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表達(dá)情況骨肉瘤患者生存情況的比較

miRNA-30a、miRNA-30c陽(yáng)性表達(dá)骨肉瘤患者平均生存時(shí)間均長(zhǎng)于miRNA-30a、miRNA-30c陰性表達(dá)骨肉瘤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.82、3.87、P＜0.05）；miRNA-30e陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)骨肉瘤患者平均生存時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表5）

2.5 骨肉瘤患者預(yù)后影響因素的單因素分析

不同miRNA-30e表達(dá)情況骨肉瘤患者3年生存率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同miRNA-30a表達(dá)情況、miRNA-30c表達(dá)情況、Enneking外科分期、肺轉(zhuǎn)移情況和復(fù)發(fā)情況骨肉瘤患者3年生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 6）

表5 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表達(dá)情況骨肉瘤患者的生存情況（月，±s）

表5 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表達(dá)情況骨肉瘤患者的生存情況（月，±s）

指標(biāo)m i R N A-3 0 a表達(dá)陽(yáng)性（n=5）陰性（n=2 7）m i R N A-3 0 c表達(dá)陽(yáng)性（n=7）陰性（n=2 5）m i R N A-3 0 e表達(dá)陽(yáng)性（n=8）陰性（n=2 4）4 1.3±4.2 2 8.2±1.6 3 9.7±5.1 2 4.9±2.2 2 9.7±1.8 3 5.1±3.5生存時(shí)間

表6 骨肉瘤患者預(yù)后影響因素的單因素分析（n=32）

2.6 骨肉瘤患者預(yù)后影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA-30a表達(dá)情況、miRNA-30c表達(dá)情況、Enneking外科分期、肺轉(zhuǎn)移情況和復(fù)發(fā)情況作為自變量，骨肉瘤患者生存情況作為因變量納入Cox分析，結(jié)果顯示，miRNA-30a陰性表達(dá)和發(fā)生肺轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表7）

表7 骨肉瘤患者預(yù)后影響因素的多因素Cox分析（n=32）

3 討論

目前，多項(xiàng)研究探討了miRNA家族在骨肉瘤表達(dá)中的意義。Hong等[16]分析了血清miRNA-29家族成員表達(dá)水平在骨肉瘤篩查中的作用，結(jié)果表明，miRNA-29家族能夠作為高級(jí)別骨肉瘤篩查的標(biāo)志物，但作為低級(jí)別骨肉瘤篩查的靈敏度和特異度不足。miRNA-30家族以不同方式參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可通過(guò)下調(diào)防止腫瘤發(fā)生的蛋白的表達(dá)發(fā)揮致癌因子的作用，又可作為抑癌因子抑制原癌基因蛋白的表達(dá)。miRNA-30a在滑膜肉瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，而在非小細(xì)胞肺癌和骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)。miRNA-30a在卵巢癌[8]、膀胱癌[9]、肝癌[10]、黑色素瘤[11]和皮膚鱗狀細(xì)胞癌[12]等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常骨組織。張汝益等[17]研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤143B細(xì)胞株中miRNA-30a呈明顯低表達(dá)，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的miRNA-30a可能抑制人骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和活力，并部分通過(guò)抑制Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）的翻譯發(fā)揮作用，與本研究結(jié)果一致。此外，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)通常在惡性腫瘤細(xì)胞中呈上調(diào)狀態(tài)。STAT3的主要作用是通過(guò)STAT3/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路引起炎性微環(huán)境的改變，其主要負(fù)責(zé)炎癥誘發(fā)腫瘤和抗腫瘤反應(yīng)[17]。Chen等[18]通過(guò)研究膠質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)，miRNA-30的表達(dá)水平與STAT3呈負(fù)相關(guān)，且STAT3可以激活正常細(xì)胞中miRNA-30b的表達(dá)并上調(diào)miRNA-30b的表達(dá)從而對(duì)STAT3的表達(dá)發(fā)揮負(fù)反饋的調(diào)節(jié)作用。這意味著miRNA-30可能通過(guò)下調(diào)STAT3的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)。

本研究首先采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)了miRNA-30家族5種成員在骨肉瘤組織和正常骨組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，骨肉瘤患者骨肉瘤組織中 miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常骨組織，提示這3種miRNA-30家族成員可能在骨肉瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。這一研究結(jié)果，與既往關(guān)于miRNA-30家族在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致。

目前，熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)是檢測(cè)miRNA表達(dá)的常規(guī)方法，能夠檢測(cè)組織中極其微量的miRNA，但熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)不能對(duì)miRNA在組織和細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行定位分析。因此，本研究進(jìn)一步采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)這3種miRNA-30家族成員在骨肉瘤及正常骨組織中的表達(dá)情況，結(jié)果一方面與熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)結(jié)果一致，即這3種miRNA在骨肉瘤組織中低表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miRNA-30a表達(dá)情況可能與骨肉瘤患者的性別、腫瘤部位及分化程度無(wú)關(guān)，與Enneking外科分期、復(fù)發(fā)情況及肺轉(zhuǎn)移情況有關(guān)；miRNA-30c表達(dá)情況可能與骨肉瘤患者的Enneking外科分期有關(guān)；miRNA-30e表達(dá)情況可能與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。最后本研究采用單因素和多因素Logstic回歸分析探討影響骨肉瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，結(jié)果表明，miRNA-30a陰性表達(dá)和發(fā)生肺轉(zhuǎn)移情況是骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，miRNA-30a能夠抑制骨肉瘤發(fā)展，是預(yù)測(cè)骨肉瘤患者生存的潛在有效生物標(biāo)志物和有效治療靶點(diǎn)。