張敏，馮怡錕，張巖，付文靜，常佳，任景麗

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，鄭州 450000

結(jié)直腸腺癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，居惡性腫瘤死亡原因的第二位，且近年來(lái)其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。盡管以手術(shù)為主，結(jié)合放射治療、化學(xué)治療和生物治療等的綜合治療在臨床取得了一定進(jìn)展，但結(jié)直腸腺癌的5年生存率仍為50%～60%，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌患者預(yù)后更差[2]。侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的關(guān)鍵性因素，其轉(zhuǎn)移的潛在性通常難以預(yù)測(cè)。結(jié)直腸腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)包括腫瘤細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、基質(zhì)降解和新生血管生成等多方面的復(fù)雜過(guò)程[3]。近年的研究表明，多種生物學(xué)指標(biāo)與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和基膜（basement membrane，BM），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織擴(kuò)散，從而對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響[5]。ADAM金屬肽酶域17（ADAM metallopeptidase domain 17，ADAM17）是ADAM蛋白家族的成員之一，又名腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶（tu-mor necrosis factor-alphaconverting enzyme，TACE），已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中均有高表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用[6]。E鈣黏蛋白（E-cadherin）作為重要的黏附分子，其低表達(dá)對(duì)于腫瘤發(fā)展具有重要作用[7]。本研究采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測(cè)結(jié)直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17及E-cadherin的表達(dá)情況，并與腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織進(jìn)行對(duì)比，探討其在結(jié)直腸腺癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年7月至2018年10月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診的結(jié)直腸腺癌患者的病歷資料。所有患者均有詳細(xì)的臨床資料和手術(shù)記錄，且術(shù)前均未進(jìn)行放、化療，所有標(biāo)本均經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色篩選。共納入120例結(jié)直腸腺癌患者作為結(jié)直腸腺癌組，其中男66例，女54例；年齡37～77歲，平均（60.33±12.14）歲；腫瘤直徑：＜3 cm 56例，≥3 cm 64例；分化程度：高分化26例，中分化67例，低分化27例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例；有漿膜浸潤(rùn)58例，無(wú)漿膜浸潤(rùn)62例。從中選取30例患者作為正常結(jié)直腸黏膜組，其中男19例，女11例；年齡40～77歲，平均（59.41±11.63）歲。另取56例行同期手術(shù)切除和纖維結(jié)腸鏡活檢的結(jié)直腸腺瘤患者作為結(jié)直腸腺瘤組，其中男 31例，女 25例；年齡 39～75歲，平均（58.17±10.48）歲。3組研究對(duì)象性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。分別取結(jié)直腸腺癌組、正常結(jié)直腸黏膜組[結(jié)直腸腺癌標(biāo)本陰性殘端處（據(jù)腫瘤邊緣大于15 cm，且無(wú)壞死）相對(duì)正常的結(jié)直腸黏膜（病理證實(shí)）]、結(jié)直腸腺瘤組患者的相應(yīng)組織標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗人MMP2、ADAM17及E-cadherin多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，PⅤ-9000二抗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP2、ADAM17及E-cadherin 蛋白表達(dá)情況

參照PⅤ-9000試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)組織蠟塊進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化、枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，滴加一抗，4℃過(guò)夜；采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次2 min，滴加MMP2、ADAM17及E-cadherin一抗。在4℃下孵育過(guò)夜。用PBS沖洗3遍，每次2 min，加入二抗，在室溫下孵育20 min，PBS沖洗，滴加DAB顯色。蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。用已知的結(jié)直腸腺癌陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

由兩名受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的臨床病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，MMP2、ADAM17陽(yáng)性表達(dá)為腫瘤細(xì)胞質(zhì)黃棕色著色，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)黃棕色著色。于高倍鏡（400倍）下隨機(jī)選取10個(gè)視野，依據(jù)以下準(zhǔn)則判定陽(yáng)性表達(dá)。①染色程度：0分，無(wú)色；1分，淺黃色；2分，黃色；3分，棕黃色。②陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。陽(yáng)性強(qiáng)度為兩種計(jì)分方式評(píng)分之和：0分為陰性（-），1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～5分為陽(yáng)性（++），6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中MMP2、ADAM17及cadherin陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

結(jié)直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17陽(yáng)性表達(dá)率均高于結(jié)直腸腺瘤組織和正常結(jié)直腸黏膜組織，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率低于結(jié)直腸腺瘤組織及正常結(jié)直腸黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組織中MMP2、ADAM17及E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征的結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17及cadherin陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤(rùn)結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中MMP2陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（χ2=5.27、19.71、13.43、13.17、5.93，P＜0.05）。不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤(rùn)結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中ADAM17陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.51、17.11、11.66、13.38、8.50，P＜0.05）。不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤(rùn)結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.42、2.41、8.48、6.59、7.05，P＜0.05）。不同年齡、性別的結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17、E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中MMP2、ADAM17及E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)情況（n=120）

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤最本質(zhì)的特征之一，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因之一，它是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多步驟的腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離、侵犯周?chē)M織、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)、逃避免疫監(jiān)視、血管形成以及在遠(yuǎn)隔器官形成轉(zhuǎn)移灶等[8]。MMP是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要家族之一，而MMP2是MMP家族中分布最廣的成員，屬于明膠酶類，可作用于Ⅳ型膠原。既往研究顯示MMP2在多種腫瘤組織中表達(dá)量顯著高于相應(yīng)正常黏膜組織，提示MMP2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并指出了為腫瘤干預(yù)治療而對(duì)MMP2進(jìn)行相關(guān)研究的重要性[9]。在本研究中，MMP2在結(jié)直腸腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于直腸腺瘤組織及正常結(jié)直腸黏膜組織；而對(duì)于結(jié)直腸腺癌患者，腫瘤直徑越大、組織分化程度越低、TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及漿膜浸潤(rùn)者M(jìn)MP2陽(yáng)性表達(dá)率越高，說(shuō)明MMP2與結(jié)直腸腺癌的惡性程度有關(guān)，可以降解ECM和BM，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。高雙英等[10]研究顯示，當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)常伴隨著MMP2表達(dá)的增高，在部分腫瘤中還發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤惡性程度的增高，MMP2的表達(dá)也增高，且與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

ADAM17是ADAM家族成員之一，最初被認(rèn)為是TNF釋放酶而被發(fā)現(xiàn)，其功能多樣，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤中均有表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比較于結(jié)直腸腺瘤組織及正常結(jié)直腸黏膜組織，結(jié)直腸腺癌組織中ADAM17陽(yáng)性表達(dá)率升高，對(duì)ADAM17表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床特征的分析顯示ADAM17高陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及漿膜浸潤(rùn)有關(guān)，提示ADAM17的表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。此結(jié)果與乳腺癌的研究結(jié)果類似，ADAM17抑制劑通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體配體的釋放，減少表皮生長(zhǎng)因子反應(yīng)性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速率及轉(zhuǎn)移持續(xù)性[12]。有關(guān)ADAM17參與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確，由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多步驟的相互作用過(guò)程，包括惡性腫瘤從原發(fā)灶脫離、穿過(guò)ECM和BM，穿過(guò)血管壁進(jìn)入宿主微環(huán)境等步驟[13]。ADAM17可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)通過(guò)參與不同調(diào)節(jié)途徑發(fā)揮了作用。相關(guān)研究證實(shí)ADAM17能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞使其黏附于相鄰細(xì)胞及ECM，這可能是腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的起始步驟[14]。ECM和BM的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要步驟，ECM的降解需要專一的蛋白水解酶的作用，而ADAM17被證明是這一蛋白水解酶的類似物，其高表達(dá)能產(chǎn)生類似的降解作用，從而破壞ECM屏障促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。

E-cadherin是一類介導(dǎo)同型細(xì)胞相互黏附的跨膜糖基質(zhì)蛋白質(zhì)，在機(jī)體的胚胎組織、成熟組織的上皮細(xì)胞和增生活躍的上皮細(xì)胞中高表達(dá)，其自身除了可以調(diào)節(jié)胚胎組織的發(fā)育、上皮組織的形成、細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞交流外，還對(duì)促進(jìn)細(xì)胞間黏附、保持上皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)功能的完整性有重要價(jià)值[16]。研究顯示，E-cadherin表達(dá)下調(diào)或出現(xiàn)功能改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間的黏附性下降，從而脫離原病灶，并具有發(fā)生侵襲的可能，此時(shí)腫瘤細(xì)胞易于從原病灶脫落分離，向淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及漿膜浸潤(rùn)有關(guān)，提示E-cadherin與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)直腸腺癌在發(fā)展過(guò)程中，伴隨著緊密連接的破壞、黏附力的下降，引起腫瘤細(xì)胞侵襲能力的增加，使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，容易通過(guò)淋巴管或血管發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而當(dāng)細(xì)胞黏附缺失使組織結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞后，可使細(xì)胞間變得松散，腫瘤細(xì)胞易脫落，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。

目前腫瘤的治療越來(lái)越傾向于個(gè)體化，而個(gè)體化的治療依賴于準(zhǔn)確的術(shù)前診斷和評(píng)估。本研究證明MMP2、ADAM17隨結(jié)直腸腺癌癌變程度、浸潤(rùn)程度加深及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，陽(yáng)性表達(dá)率升高；E-cadherin隨結(jié)直腸腺癌癌變程度、浸潤(rùn)程度加深及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，陽(yáng)性表達(dá)率降低。這提示MMP2、ADAM17過(guò)表達(dá)及E-cadherin缺失可能引起腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。因此，綜合分析上述3項(xiàng)指標(biāo)，可為結(jié)直腸腺癌患者臨床診斷、預(yù)后判斷及個(gè)體化治療提高理論依據(jù)，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。