廖朝選，黃永橋，毛敏霞，王波娜，王正強(qiáng)，楊昌彪

(貴州省分析測(cè)試研究院，貴陽(yáng) 550014)

喹諾酮類(lèi)藥物(Quinolones)是近年來(lái)研究較多的一類(lèi)抗菌藥，因其具有抗菌譜廣、高效、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，常作為飼料添加劑用于畜禽及水產(chǎn)品養(yǎng)殖，廣泛用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療以及促生長(zhǎng)等作用[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用喹諾酮類(lèi)藥物會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物食品中存在藥物殘留，影響人體健康。喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良反應(yīng)，可致重癥肌無(wú)力癥狀加重、呼吸肌無(wú)力而危及生命，有潛在的致癌性和遺傳性，且易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性等危害[3-6]，引起了人們的廣泛關(guān)注。我國(guó)、日本及世界衛(wèi)生組織、歐盟等國(guó)家和組織都將喹諾酮類(lèi)藥物列入限制使用的獸藥名單中，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部2015年公布的第2292號(hào)公告中規(guī)定禁止在動(dòng)物食品中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥。

有報(bào)道顯示，為了防止豆制品變酸，延長(zhǎng)其保質(zhì)期，有商販非法添加抗生素[7,8]。喹諾酮類(lèi)主要用于動(dòng)物疾病的防治，由于其優(yōu)良的抗菌活性，非法用于食品生產(chǎn)已有相關(guān)報(bào)道[9]，豆制品不易保存的特點(diǎn)，也是喹諾酮類(lèi)抗生素潛在的非法添加目標(biāo)。當(dāng)前，關(guān)于食品中喹諾酮類(lèi)藥物的檢測(cè)方法較多，多集中于動(dòng)物源食品[10-12]，對(duì)于水、蔬菜及麻辣燙等不同基質(zhì)的檢測(cè)方法也有相關(guān)報(bào)道[13-15]，已經(jīng)較為成熟，但關(guān)于豆制品中的檢測(cè)方法研究較少。為了遏止一些不法商販非法使用喹諾酮類(lèi)抗生素，產(chǎn)生食品安全問(wèn)題，建立豆制品中快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法十分必要。本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法結(jié)合UHPLC-MS/MS聯(lián)用儀建立了同時(shí)測(cè)定豆制品中16種喹諾酮類(lèi)藥物殘留的同時(shí)確證分析方法，為食品安全監(jiān)管相關(guān)工作提供了可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹(純度>97%)16種喹諾酮類(lèi)混標(biāo)溶液：100 μg/mL；諾氟沙星-D5溶液：100 μg/mL；環(huán)丙沙星-D8溶液：100 μg/mL；恩諾沙星-D5溶液：100 μg/mL，均購(gòu)于天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、甲醇(色譜純)：德國(guó)Merck公司；甲酸(色譜純)、HLB(200 mg/6 mL)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；陶瓷均質(zhì)子：迪馬科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(配有電噴霧離子源) 美國(guó)Agilent公司；Blixer 3攪拌機(jī) 法國(guó)ROBOT COUPA公司； LT2002電子天平 常熟市天量?jī)x器有限公司；UMV-2多管渦旋混合器 北京普立泰科儀器有限公司；離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器 上海米青科實(shí)業(yè)有限公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó) Millipore公司；0.22 μm PTFE針式濾膜 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別從16種喹諾酮類(lèi)混標(biāo)溶液、諾氟沙星-D5溶液、環(huán)丙沙星-D8溶液、恩諾沙星-D5溶液安瓿瓶中準(zhǔn)確移取1.00 mL于不同10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，混勻，配制成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃下保存3個(gè)月。

中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確移取0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于不同10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋成500 ng/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取不同體積的中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于不同10 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相稀釋成0.50～50.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)為5.0 ng/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)，美國(guó)Agilent公司；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液流動(dòng)相，B：乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積2.0 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；霧化器壓力：45 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件Table 2 MS parameters

續(xù) 表

1.3.3 樣品前處理

提?。悍Q(chēng)取5.0 g均勻樣品(精確至0.001 g)，置于50 mL離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.1 mL，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，加入25 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋混勻10 min，4500 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL比色管中，殘?jiān)?.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液重復(fù)提取2次，每次10 mL，合并上清液至同一比色管中，用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液定容至刻度，混勻。用濾紙過(guò)濾(必要時(shí)離心后過(guò)濾)，續(xù)濾液待凈化。

凈化：精密吸取上述待凈化液10.0 mL，以約1 mL/min的流速全部通過(guò)HLB固相萃取小柱(上樣前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化)，用3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，抽干，用6 mL甲醇洗脫并收集，45 ℃氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL流動(dòng)相初始比例復(fù)溶液溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm PTFE濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化

本研究對(duì)比了使用0.1%甲酸乙腈溶液提取后，氮吹干用正己烷去除油脂和0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化的凈化效果。結(jié)果表明，使用0.1%甲酸乙腈溶液的方法雖然快速簡(jiǎn)單，但其去除干擾物質(zhì)的能力比HLB固相萃取小柱略差。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)使用渦旋振蕩提取和超聲提取效果及其提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終確立樣品加入0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，渦旋振蕩提取10 min，HLB固相萃取小柱凈化的樣品前處理過(guò)程。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本研究采用超高效液相反相C18色譜柱對(duì)喹諾酮類(lèi)化合物進(jìn)行分離，因?yàn)?6種喹諾酮類(lèi)化合物均為正離子模式，研究表明[16]在水相中加入一定比例的甲酸能有效促進(jìn)目標(biāo)物的電離，故實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星等化合物很難在色譜條件下將其完全分離，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇和乙腈對(duì)16種喹諾酮類(lèi)藥物化合物分離的影響。當(dāng)使用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，目標(biāo)物雖然響應(yīng)值更大，但目標(biāo)物的分離度較差，尤其是氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星等基本重合，無(wú)法分開(kāi)；使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星等化合物有較好的分離度，且各化合物的響應(yīng)值較好。因此綜合考慮，實(shí)驗(yàn)使用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系，具體洗脫條件見(jiàn)表1。16種喹諾酮類(lèi)化合物混標(biāo)溶液的重構(gòu)離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 16種喹諾酮類(lèi)化合物混標(biāo)溶液重構(gòu)離子色譜圖(5 μg/L)Fig.1 Reconstructed ion chromatogram of mixed standard solution of 16 quinolones注：1～16分別表示依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹。

2.3 質(zhì)譜條件選擇

根據(jù)喹諾酮類(lèi)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，易得到H+而形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，故本研究選擇正離子模式監(jiān)測(cè)，采取直接接雙通的方法，在正離子模式下一級(jí)全掃描質(zhì)譜得到相應(yīng)準(zhǔn)分子離子峰，優(yōu)化錐孔電壓，再分別以準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行二級(jí)子離子掃描，選擇特征碎片中離子中響應(yīng)值高、基線噪聲低、干擾小的兩對(duì)離子對(duì)作為定性、定量離子對(duì)，通過(guò)優(yōu)化其碰撞能量、毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度和壓力等質(zhì)譜參數(shù)，盡可能使目標(biāo)物的響應(yīng)值達(dá)到最大，經(jīng)優(yōu)化后得到表2的質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用ESI源質(zhì)譜儀分析食品中獸藥殘留時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)是影響儀器靈敏度和重現(xiàn)性的常見(jiàn)因素，同位素內(nèi)標(biāo)法因其性質(zhì)與目標(biāo)物相似，在樣品中損失和受基質(zhì)影響程度相同，是常用來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)、提高定量準(zhǔn)確性的一種方法[17]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品對(duì)16種喹諾酮類(lèi)化合物均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3，抑制效應(yīng)在47.4%～90.9%之間，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物的影響較大。為降低基質(zhì)效應(yīng)，確保方法的靈敏度、重現(xiàn)性和定量分析的準(zhǔn)確性，本方法在樣品處理和配制標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物。方法選用諾氟沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、恩諾沙星-D5作為相應(yīng)16種喹諾酮類(lèi)化合物的內(nèi)標(biāo)物，每種化合物內(nèi)標(biāo)依據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008[18]，16種喹諾酮類(lèi)化合物對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物見(jiàn)表2。

表3 16種喹諾酮類(lèi)化合物基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effects of 16 quinolones

續(xù) 表

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在本研究所確定的色譜和質(zhì)譜條件下，以定溶溶液配制系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物離子對(duì)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，分別繪制16種喹諾酮類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。通過(guò)向陰性樣品中添加目標(biāo)物來(lái)考察方法的檢出限(LOD，S/N=3)，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，16種喹諾酮類(lèi)藥物在0.50～50.00 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.99以上，檢出限(LOD)均為0.50 μg/kg。

表4 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 4 The linear equations, regression coefficients and limits of determination

2.5.2 方法精密度和回收率

采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，選取豆腐陰性樣品，分別在檢出限的1倍、2倍和10倍添加濃度下，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，豆腐樣品加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖2，結(jié)果見(jiàn)表5。16種喹諾酮類(lèi)藥物平均回收率在80.7%～107.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.5%～10.6%之間，說(shuō)明該方法具有較高的回收率和精密度，適用于豆制品中不同濃度的喹諾酮類(lèi)藥物殘留定性定量的檢測(cè)分析要求。

圖2 豆腐中16種喹諾酮類(lèi)化合物加標(biāo)MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 16 quinolones in tofu (5 μg/kg)

表5 加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 5 The recovery rates and precision (n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了豆制品中16種喹諾酮類(lèi)藥物殘留的同位素內(nèi)標(biāo)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)分析方法。樣品以0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化和同位素內(nèi)標(biāo)法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，使方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿(mǎn)足喹諾酮類(lèi)藥物殘留分析檢測(cè)的要求。實(shí)驗(yàn)表明，16種喹諾酮類(lèi)藥物在9 min內(nèi)完成分析，在0.50～50.00 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，檢出限為0.5 μg/kg，在檢出限的1倍、2倍和10倍添加濃度下，16種喹諾酮類(lèi)藥物平均回收率在80.7%～107.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.5%～10.6%之間。該方法分析結(jié)果能滿(mǎn)足16種喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)限量、回收率和精密度的分析要求，適用于豆制品中喹諾酮類(lèi)藥物殘留的分析檢測(cè)。