夏杰 李松梅 馬殿飛

摘要： 目的 通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討六味二至加味方治療狼瘡性腎炎的作用機(jī)理。方法 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)TCMSP和ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選六味二至加味方所含有效化合物，分別運(yùn)用Drugbanke、Swisstarget prediction和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲取六味二至加味方的作用靶標(biāo)基因和狼瘡性腎炎疾病相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)基因，將兩者取交集后得到疾病-藥物蛋白靶基因，利用STRING軟件將構(gòu)建的靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)間加權(quán)重聯(lián)系的計(jì)算分析法篩選出重要的關(guān)鍵基因。結(jié)果 六味二至加味方與狼瘡性腎炎疾病靶標(biāo)基因的交集基因有39個(gè)。結(jié)論 六味二至加味方治療狼瘡性腎炎是多靶點(diǎn)的復(fù)雜機(jī)制過(guò)程，其機(jī)制多與抗炎、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 狼瘡性腎炎;六味二至加味方;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用靶點(diǎn)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種自身免疫性疾病，年輕中年女性多為好發(fā)群體，以20-40歲為主[1]。SLE患者幾近均有腎臟損害，其多數(shù)表現(xiàn)為狼瘡性腎炎（LN），以水腫，蛋白尿，血尿?yàn)橹鳎踔猎斐赡I功能衰竭和尿毒癥，LN患者生存率及生活質(zhì)量不高，預(yù)后較差。中醫(yī)無(wú)與狼瘡性腎炎相應(yīng)的名稱和系統(tǒng)論述，中醫(yī)通常認(rèn)為本病病位在腎，腎虛是LN發(fā)病的內(nèi)在因素[2]。孟如教授認(rèn)為：狼瘡性腎炎多為內(nèi)外合因所致，外因?yàn)楦惺苄盁?，郁久成毒，進(jìn)而內(nèi)舍五臟六腑?；凇案文I同源”的理論，采用滋腎養(yǎng)陰活血法，從肝腎論治，創(chuàng)制六味二至加味方。該方是孟如教授四十余年對(duì)中醫(yī)風(fēng)濕免疫理論深入探討及臨床研究而形成的經(jīng)驗(yàn)方，臨床研究表明六味二至加味方治療LN具有顯著的臨床療效[3-4]。

目前，動(dòng)物、細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)雖可對(duì)某一機(jī)制進(jìn)行研究，但難以揭示復(fù)方中藥分子機(jī)制系統(tǒng)性。隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，采用多成分、多靶點(diǎn)的思路闡明了藥物發(fā)揮作用多層次網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5]。基于此，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步挖掘中藥復(fù)方六味二至加味方治療LN的分子機(jī)制，預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)及相關(guān)疾病信息，為開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 六味二至加味方所含化合物的收集與篩選 將六味二至加味方組成生地黃、山茱萸，山藥，茯苓，丹參等11 味中藥分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，ETCM）[6]，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）設(shè)置為≥30%，類藥性指數(shù)（drug like index，DL）設(shè)置為≥0.10，查詢并篩選該數(shù)據(jù)庫(kù)中所包含的上述11味中藥的有效活性成分，ETCM中所搜集的成分保留Druglikeness Grading 為Moderate和Good。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所篩選保留下來(lái)的成分，進(jìn)一步根據(jù)篩選先導(dǎo)化合物的原則：分子質(zhì)量MW在100-380之間，脂水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值在0-3，氫鍵供體≤5，氫鍵受體≤10，篩選出藥代動(dòng)力學(xué)特性和成藥性較優(yōu)的活性成分。

1.2 六味二至加味方作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)[7] 藥物分子與特定的靶點(diǎn)相結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)其生物活性及轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用。為了闡明藥物的作用機(jī)制，收集化合物作用靶點(diǎn)，對(duì)1.1中篩選的活性成分在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行SMILE結(jié)構(gòu)式轉(zhuǎn)換后導(dǎo)入Swisstargetpredicti-ion（http：//www.swisstargetpredict-ion.ch）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)活性成分的靶點(diǎn)。

1.3 六味二至加味方有效化合物與其作用靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了闡明六味二至加味方治療LN的制，本研究采用cytoscape3.6.0軟件[8]構(gòu)建六味二至加味方活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，該網(wǎng)絡(luò)中，化合物和靶點(diǎn)以節(jié)點(diǎn)表示，2個(gè)節(jié)點(diǎn)間相互作用由邊表示，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性通過(guò)拓?fù)鋮?shù)度數(shù)進(jìn)行評(píng)估，度數(shù)越大，說(shuō)明與該節(jié)點(diǎn)相關(guān)的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，則該節(jié)點(diǎn)越重要。節(jié)點(diǎn)度數(shù)由Cytoscape插件Network Analyzer 進(jìn)行分析。根據(jù)Degree分析結(jié)果，保留Degree≥10的靶點(diǎn)和成分，作為復(fù)方的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 LN發(fā)病靶點(diǎn)檢索及六味二至加味方作用LN相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)[9-11] 在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctdbase.org/）及Disgenet數(shù)據(jù)（https：//www.disgenet.org）中以Lupus Nephritis為關(guān)鍵詞搜索LN疾病相關(guān)靶點(diǎn)。本研究取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共有靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析研究。將六味二至加味方作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）軟件，得到交集靶點(diǎn)，即六味二至加味方作用LN的靶點(diǎn)。

1.5 六味二至加味方對(duì)LN作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了獲得六味二至加味方對(duì)LN作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，將六味二至加味方對(duì)LN的靶點(diǎn)上傳至STRING 10.5 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）[12]，選擇研究人類物種，設(shè)置靶點(diǎn)之間最低要求聯(lián)系分?jǐn)?shù)為0.4，并隱藏不與其他靶點(diǎn)聯(lián)系的靶點(diǎn)，得到靶點(diǎn)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖。將該圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 六味二至加味方所含化合物的收集與篩選結(jié)果 篩選出六味二至加味方的活性化合物共108個(gè)，其中地黃有效成分1個(gè)，山茱萸16個(gè)，山藥9個(gè)，茯苓1個(gè)，澤瀉11個(gè)，牡丹皮8個(gè)，小薊3個(gè)，益母草12個(gè)，丹參33個(gè)，墨旱蓮11個(gè)，女貞子3個(gè)。

2.2 六味二至加味方有效化合物作用LN 相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 2.1中82個(gè)化合物共檢索出2137 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)建C-T圖，根據(jù)Degree分析結(jié)果，保留Degree≥10的靶點(diǎn)和成分，作為復(fù)方的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，共167個(gè)，其中化合物毛地黃黃酮（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=19），四氫鴨腳木堿（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=19），二氫丹參內(nèi)酯（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=18），海風(fēng)藤酮（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=18），山柰酚（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=17），異鼠李素（（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=16），丹參新醌D（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=13），將每個(gè)化合物與其作用的LN靶點(diǎn)相聯(lián)系，通過(guò)Cytoscape 3.7.0 軟件做出化合物-靶點(diǎn)聯(lián)系圖（見圖1）。運(yùn)用軟件中自帶的NetworkAnalyzer 插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度（degree）。越高的數(shù)值說(shuō)明其相對(duì)應(yīng)的化合物、靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越關(guān)鍵。表明它們是六味二至加味方治療LN的主要有效化合物和靶點(diǎn)。

2.3 LN相關(guān)靶點(diǎn)檢索及六味二至加味方作用LN 相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)CTD（http：//ctdbase.org/）、Disgenet（https：//www.uniprot.org/ database /DB-0218）數(shù)據(jù)庫(kù)，得分≥ 10 分的靶點(diǎn)共檢索出696個(gè)與LN 相關(guān)的靶點(diǎn)，將六味二至加味方82個(gè)有效化合物所對(duì)應(yīng)的167 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與696 個(gè)LN 相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）軟件，共得到39 個(gè)共同靶點(diǎn)，即六味二至加味方作用LN 的靶點(diǎn)，見圖2。

2.4 六味二至加味方對(duì)LN 作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 根據(jù)1.5 中要求，STRING10.5（https：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得39 個(gè)靶點(diǎn)之間共407條聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖。將圖導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲得聯(lián)系其他靶點(diǎn)個(gè)數(shù)排名前6 位的靶點(diǎn)依次是VEGFA（36 個(gè)）、TNF（32 個(gè)）、IL6（34 個(gè)）、IL10（33 個(gè)）、STAT3（33 個(gè)）、CXCL8（32 個(gè)）。六味二至加味方對(duì)LN作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

3 討論

六味二至加味方源自《金匱要略》所載之“崔氏八味丸”（仲景易名曰腎氣丸）減去桂枝、附子而成的六味地黃丸合《太平惠民和劑局方》中的二至丸化裁加味而來(lái)，二方合用滋補(bǔ)肝腎之功增強(qiáng)。此外，孟如教授指出，本病熱毒阻滯，氣滯血瘀，故在狼瘡性腎炎的治療過(guò)程中，活血化瘀法要貫穿始終。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于多靶點(diǎn)的研究思路，為我們提供了復(fù)方中藥新的策略。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，初步挖掘、分析六味二至加味方治療 LN 的可能作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，六味二至加味方和LN的交集靶基因共39個(gè)，進(jìn)一步提煉出六味二至加味方治療LN的生物學(xué)功能。研究表明[14-18]，TNF（腫瘤壞死因子）作為自身免疫炎癥反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵因子，在SLE患者的血清中，sTNFRs、TNF-α這兩項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)水平均高于健康人時(shí)，SLE發(fā)病幾率增大。VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）能發(fā)揮誘使內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及抑制凋亡的作用，研究表明，LN患者的血清中的VEGF水平明顯高于未患病對(duì)照組，推導(dǎo)VEGF水平很可能收到刺激而升高表達(dá)水平，從而在LN中發(fā)揮作用。mTOC在以下生化反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用：自噬、調(diào)控免疫分化、氧化應(yīng)激過(guò)程及炎性因子分泌，若mTOC被阻斷，有利于LN患者病情的控制。作為抗原遞呈細(xì)胞和T細(xì)胞有效抑制因子之一IL-10，不僅能抑制單個(gè)核細(xì)胞而分泌前炎癥因子，還能抑制絲裂原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)，因IL10分泌量的增加，可以相對(duì)闡明SLE疾病免疫調(diào)節(jié)的紊亂狀態(tài)。IL-6可以刺激誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖。IL-6在CRP調(diào)節(jié)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，IL-6通過(guò)與IL-R6結(jié)合，能夠促使B細(xì)胞分泌抗雙鏈DNA和IgG抗體，誘發(fā)腎小球內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖和收縮以及腎小球的血流量減少甚至加重其缺血和缺氧量，進(jìn)一步損害腎小球上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞。 通過(guò)研究LN小鼠發(fā)現(xiàn)，在其腎組織中p-STAT3 蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著高于同等條件下無(wú)腎組織損害的對(duì)照C57BL/6小鼠;同時(shí)，通過(guò)免疫組化的結(jié)果得出，BXSB小鼠腎組織細(xì)胞核是STAT1/3表達(dá)的場(chǎng)所，提示STAT1/3被活化。

綜上所述，六味二至加味方可能經(jīng)炎癥、細(xì)胞增殖及免疫因子信號(hào)通路等作用于LN，它是一種多個(gè)靶點(diǎn)的復(fù)雜的生理機(jī)制過(guò)程，本研究為闡明藥物-靶點(diǎn)之間相互作用機(jī)制提供了重要參考信息，同時(shí)也為中醫(yī)藥治療狼瘡性腎炎提供了作用機(jī)制研究方面的思路。

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（收稿日期：2020-03-11）