夏杰 李松梅 馬殿飛
摘要: 目的 通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探討六味二至加味方治療狼瘡性腎炎的作用機(jī)理。方法 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)TCMSP和ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選六味二至加味方所含有效化合物,分別運(yùn)用Drugbanke、Swisstarget prediction和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲取六味二至加味方的作用靶標(biāo)基因和狼瘡性腎炎疾病相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)基因,將兩者取交集后得到疾病-藥物蛋白靶基因,利用STRING軟件將構(gòu)建的靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示,經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)間加權(quán)重聯(lián)系的計(jì)算分析法篩選出重要的關(guān)鍵基因。結(jié)果 六味二至加味方與狼瘡性腎炎疾病靶標(biāo)基因的交集基因有39個(gè)。結(jié)論 六味二至加味方治療狼瘡性腎炎是多靶點(diǎn)的復(fù)雜機(jī)制過(guò)程,其機(jī)制多與抗炎、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。
關(guān)鍵詞: 狼瘡性腎炎;六味二至加味方;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用靶點(diǎn)
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病,年輕中年女性多為好發(fā)群體,以20-40歲為主[1]。SLE患者幾近均有腎臟損害,其多數(shù)表現(xiàn)為狼瘡性腎炎(LN),以水腫,蛋白尿,血尿?yàn)橹鳎踔猎斐赡I功能衰竭和尿毒癥,LN患者生存率及生活質(zhì)量不高,預(yù)后較差。中醫(yī)無(wú)與狼瘡性腎炎相應(yīng)的名稱和系統(tǒng)論述,中醫(yī)通常認(rèn)為本病病位在腎,腎虛是LN發(fā)病的內(nèi)在因素[2]。孟如教授認(rèn)為:狼瘡性腎炎多為內(nèi)外合因所致,外因?yàn)楦惺苄盁?,郁久成毒,進(jìn)而內(nèi)舍五臟六腑?;凇案文I同源”的理論,采用滋腎養(yǎng)陰活血法,從肝腎論治,創(chuàng)制六味二至加味方。該方是孟如教授四十余年對(duì)中醫(yī)風(fēng)濕免疫理論深入探討及臨床研究而形成的經(jīng)驗(yàn)方,臨床研究表明六味二至加味方治療LN具有顯著的臨床療效[3-4]。
目前,動(dòng)物、細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)雖可對(duì)某一機(jī)制進(jìn)行研究,但難以揭示復(fù)方中藥分子機(jī)制系統(tǒng)性。隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展,采用多成分、多靶點(diǎn)的思路闡明了藥物發(fā)揮作用多層次網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5]。基于此,本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步挖掘中藥復(fù)方六味二至加味方治療LN的分子機(jī)制,預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)及相關(guān)疾病信息,為開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供參考依據(jù)。
1 研究方法
1.1 六味二至加味方所含化合物的收集與篩選 將六味二至加味方組成生地黃、山茱萸,山藥,茯苓,丹參等11 味中藥分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP,ETCM)[6],將口服生物利用度(oral bioavailability,OB)設(shè)置為≥30%,類藥性指數(shù)(drug like index,DL)設(shè)置為≥0.10,查詢并篩選該數(shù)據(jù)庫(kù)中所包含的上述11味中藥的有效活性成分,ETCM中所搜集的成分保留Druglikeness Grading 為Moderate和Good。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所篩選保留下來(lái)的成分,進(jìn)一步根據(jù)篩選先導(dǎo)化合物的原則:分子質(zhì)量MW在100-380之間,脂水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值在0-3,氫鍵供體≤5,氫鍵受體≤10,篩選出藥代動(dòng)力學(xué)特性和成藥性較優(yōu)的活性成分。
1.2 六味二至加味方作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)[7] 藥物分子與特定的靶點(diǎn)相結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)其生物活性及轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用。為了闡明藥物的作用機(jī)制,收集化合物作用靶點(diǎn),對(duì)1.1中篩選的活性成分在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行SMILE結(jié)構(gòu)式轉(zhuǎn)換后導(dǎo)入Swisstargetpredicti-ion(http://www.swisstargetpredict-ion.ch)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)活性成分的靶點(diǎn)。
1.3 六味二至加味方有效化合物與其作用靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了闡明六味二至加味方治療LN的制,本研究采用cytoscape3.6.0軟件[8]構(gòu)建六味二至加味方活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,該網(wǎng)絡(luò)中,化合物和靶點(diǎn)以節(jié)點(diǎn)表示,2個(gè)節(jié)點(diǎn)間相互作用由邊表示,每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性通過(guò)拓?fù)鋮?shù)度數(shù)進(jìn)行評(píng)估,度數(shù)越大,說(shuō)明與該節(jié)點(diǎn)相關(guān)的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多,則該節(jié)點(diǎn)越重要。節(jié)點(diǎn)度數(shù)由Cytoscape插件Network Analyzer 進(jìn)行分析。根據(jù)Degree分析結(jié)果,保留Degree≥10的靶點(diǎn)和成分,作為復(fù)方的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)。
1.4 LN發(fā)病靶點(diǎn)檢索及六味二至加味方作用LN相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)[9-11] 在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)及Disgenet數(shù)據(jù)(https://www.disgenet.org)中以Lupus Nephritis為關(guān)鍵詞搜索LN疾病相關(guān)靶點(diǎn)。本研究取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共有靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析研究。將六味二至加味方作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)軟件,得到交集靶點(diǎn),即六味二至加味方作用LN的靶點(diǎn)。
1.5 六味二至加味方對(duì)LN作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了獲得六味二至加味方對(duì)LN作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系,將六味二至加味方對(duì)LN的靶點(diǎn)上傳至STRING 10.5 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)[12],選擇研究人類物種,設(shè)置靶點(diǎn)之間最低要求聯(lián)系分?jǐn)?shù)為0.4,并隱藏不與其他靶點(diǎn)聯(lián)系的靶點(diǎn),得到靶點(diǎn)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖。將該圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。
2 結(jié)果與分析
2.1 六味二至加味方所含化合物的收集與篩選結(jié)果 篩選出六味二至加味方的活性化合物共108個(gè),其中地黃有效成分1個(gè),山茱萸16個(gè),山藥9個(gè),茯苓1個(gè),澤瀉11個(gè),牡丹皮8個(gè),小薊3個(gè),益母草12個(gè),丹參33個(gè),墨旱蓮11個(gè),女貞子3個(gè)。
2.2 六味二至加味方有效化合物作用LN 相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 2.1中82個(gè)化合物共檢索出2137 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn),同時(shí)構(gòu)建C-T圖,根據(jù)Degree分析結(jié)果,保留Degree≥10的靶點(diǎn)和成分,作為復(fù)方的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn),共167個(gè),其中化合物毛地黃黃酮(網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=19),四氫鴨腳木堿(網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=19),二氫丹參內(nèi)酯(網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=18),海風(fēng)藤酮(網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=18),山柰酚(網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=17),異鼠李素((網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=16),丹參新醌D(網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=13),將每個(gè)化合物與其作用的LN靶點(diǎn)相聯(lián)系,通過(guò)Cytoscape 3.7.0 軟件做出化合物-靶點(diǎn)聯(lián)系圖(見圖1)。運(yùn)用軟件中自帶的NetworkAnalyzer 插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度(degree)。越高的數(shù)值說(shuō)明其相對(duì)應(yīng)的化合物、靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越關(guān)鍵。表明它們是六味二至加味方治療LN的主要有效化合物和靶點(diǎn)。
2.3 LN相關(guān)靶點(diǎn)檢索及六味二至加味方作用LN 相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)CTD(http://ctdbase.org/)、Disgenet(https://www.uniprot.org/ database /DB-0218)數(shù)據(jù)庫(kù),得分≥ 10 分的靶點(diǎn)共檢索出696個(gè)與LN 相關(guān)的靶點(diǎn),將六味二至加味方82個(gè)有效化合物所對(duì)應(yīng)的167 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與696 個(gè)LN 相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)軟件,共得到39 個(gè)共同靶點(diǎn),即六味二至加味方作用LN 的靶點(diǎn),見圖2。
2.4 六味二至加味方對(duì)LN 作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 根據(jù)1.5 中要求,STRING10.5(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得39 個(gè)靶點(diǎn)之間共407條聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖。將圖導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,獲得聯(lián)系其他靶點(diǎn)個(gè)數(shù)排名前6 位的靶點(diǎn)依次是VEGFA(36 個(gè))、TNF(32 個(gè))、IL6(34 個(gè))、IL10(33 個(gè))、STAT3(33 個(gè))、CXCL8(32 個(gè))。六味二至加味方對(duì)LN作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。
3 討論
六味二至加味方源自《金匱要略》所載之“崔氏八味丸”(仲景易名曰腎氣丸)減去桂枝、附子而成的六味地黃丸合《太平惠民和劑局方》中的二至丸化裁加味而來(lái),二方合用滋補(bǔ)肝腎之功增強(qiáng)。此外,孟如教授指出,本病熱毒阻滯,氣滯血瘀,故在狼瘡性腎炎的治療過(guò)程中,活血化瘀法要貫穿始終。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于多靶點(diǎn)的研究思路,為我們提供了復(fù)方中藥新的策略。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段,初步挖掘、分析六味二至加味方治療 LN 的可能作用機(jī)制。
本研究結(jié)果顯示,六味二至加味方和LN的交集靶基因共39個(gè),進(jìn)一步提煉出六味二至加味方治療LN的生物學(xué)功能。研究表明[14-18],TNF(腫瘤壞死因子)作為自身免疫炎癥反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵因子,在SLE患者的血清中,sTNFRs、TNF-α這兩項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)水平均高于健康人時(shí),SLE發(fā)病幾率增大。VEGFA(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A)能發(fā)揮誘使內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及抑制凋亡的作用,研究表明,LN患者的血清中的VEGF水平明顯高于未患病對(duì)照組,推導(dǎo)VEGF水平很可能收到刺激而升高表達(dá)水平,從而在LN中發(fā)揮作用。mTOC在以下生化反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用:自噬、調(diào)控免疫分化、氧化應(yīng)激過(guò)程及炎性因子分泌,若mTOC被阻斷,有利于LN患者病情的控制。作為抗原遞呈細(xì)胞和T細(xì)胞有效抑制因子之一IL-10,不僅能抑制單個(gè)核細(xì)胞而分泌前炎癥因子,還能抑制絲裂原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng),因IL10分泌量的增加,可以相對(duì)闡明SLE疾病免疫調(diào)節(jié)的紊亂狀態(tài)。IL-6可以刺激誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖。IL-6在CRP調(diào)節(jié)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用,IL-6通過(guò)與IL-R6結(jié)合,能夠促使B細(xì)胞分泌抗雙鏈DNA和IgG抗體,誘發(fā)腎小球內(nèi)的炎癥反應(yīng),從而誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖和收縮以及腎小球的血流量減少甚至加重其缺血和缺氧量,進(jìn)一步損害腎小球上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞。 通過(guò)研究LN小鼠發(fā)現(xiàn),在其腎組織中p-STAT3 蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著高于同等條件下無(wú)腎組織損害的對(duì)照C57BL/6小鼠;同時(shí),通過(guò)免疫組化的結(jié)果得出,BXSB小鼠腎組織細(xì)胞核是STAT1/3表達(dá)的場(chǎng)所,提示STAT1/3被活化。
綜上所述,六味二至加味方可能經(jīng)炎癥、細(xì)胞增殖及免疫因子信號(hào)通路等作用于LN,它是一種多個(gè)靶點(diǎn)的復(fù)雜的生理機(jī)制過(guò)程,本研究為闡明藥物-靶點(diǎn)之間相互作用機(jī)制提供了重要參考信息,同時(shí)也為中醫(yī)藥治療狼瘡性腎炎提供了作用機(jī)制研究方面的思路。
參考文獻(xiàn):
[1]葛均波,敘永健.內(nèi)科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:815.
[2]潘艷麗,張立亭.張鳴鶴教授治療狼瘡性腎炎的經(jīng)驗(yàn)介紹[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎,2012,1(5):53-55.
[3]李廣文.孟如教授對(duì)疑難病的診治特色[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2000,7(6):75.
[4]吉勤,詹青主編.孟如中醫(yī)之路[M].云南:云南科技出版社,2013.172-175.
[5]解靜,高杉.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展與應(yīng)用策略[J].中草藥,2019,50(10):2257-2265.
[6]陳凱,劉馨,管怡晴,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建新型中藥復(fù)方降壓抗纖方抗高血壓心肌纖維化的作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2018,24(20):115-122.
[7]吳丹,高耀.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的柴胡抗抑郁作用機(jī)制研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào) 2018,53 (2):210-219.
[8]袁長(zhǎng)勝,陳文.基于TCMSP對(duì)玫瑰花黃酮和揮發(fā)油防治心血管疾病的協(xié)同作用及其機(jī)制研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2016,34(6):731-738.
[9]徐文華,趙新望.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)葛根素注射液對(duì)高血壓的作用機(jī)制[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2019,30(5):1249-1253.
[10]Jie WU,Jing-yun XIANG.Molecular Mechanism of Aconite-Ginger Muscle against Myocardial Ischemia Injury Based on Network Pharmacology[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2018,32(4):313-314.
[11]陳鴻儒,陳聰,曾懷才.Hsa-miR-10a-5p 靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué),2019,17(3):189-194.
[12]陳俊,陳青山.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的肝力保膠囊保肝作用機(jī)制研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2018,36(5):403-416.
[13]許強(qiáng),黃宏羽.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討加味桃核承氣湯治療2型糖尿病的作用機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2019,25(22):166-174.
[14]張玲英,洪華.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者腫瘤壞死因子、白介素8水平及意義[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,20(1):67-68.
[15]周玲,柴華旗.狼瘡性腎炎患者血清VEGF、PIGF 的表達(dá)水平及意義[J].山東醫(yī)藥,2011,51(37):25-27.
[16]王慧娟.IL-10 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制中的角色[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè),2001,24(6):317-320.
[17]徐青青,蔡露茜.IL-17、IL-6在狼瘡性腎炎中的表達(dá)及與疾病活動(dòng)度的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2019,48(1):38-41.
[18]張玉軍,劉淑霞,楊敏.狼瘡性腎炎小鼠腎組織中 HMGB1、TLR4、 STAT3、PCNA 的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(8):26-29.
(收稿日期:2020-03-11)