翁英華

莆田市秀嶼區(qū)醫(yī)院，莆田，351146，中國

非心源性缺血性腦卒中是在老年人群中發(fā)病率、致殘率、致死率和復(fù)發(fā)率均居高不下的心腦血管疾病。腦血管血液供應(yīng)不足可導(dǎo)致腦組織功能障礙，進(jìn)而發(fā)展成腦卒中，并引發(fā)神經(jīng)功能惡化（early neurological deterioration,END）［1-3］。阿托伐他汀鈣屬于HMGCoA 還原酶抑制劑，是目前臨床使用的一線降血脂藥，國內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道阿托伐他汀鈣不僅能抗動脈粥樣硬化，還可改善神經(jīng)功能，保護(hù)腦組織神經(jīng)元［4-6］。

本研究通過給腦卒中SD 大鼠灌胃阿托伐他汀，觀察阿托伐他汀對其神經(jīng)功能的影響，并對其作用機(jī)理進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

挑選SPF 級SD 雄性大鼠30 只，年齡6～7 w，體質(zhì)量220～260 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2020-0017。動物空調(diào)房溫度為24℃，購買后在動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。數(shù)字標(biāo)記后隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組，模型組和阿托伐他汀組。對模型組和阿托伐他汀組大鼠建立非心源性缺血性腦卒中模型，假手術(shù)組不阻塞頸內(nèi)動脈。

1.2 藥物、試劑和儀器

阿托伐他汀，購自于輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20 070060；TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒，購自美國Roche 公司；全自動酶聯(lián)免疫分析儀及配套的酶聯(lián)免疫吸附血清炎癥因子水平檢測試劑盒（白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β，均購自深圳庫貝爾生物科技有限公司；大鼠神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65、p-I κB、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）和β-actin 單克隆抗體，均購自美國Santa Cruz 公司。

DYY-1C 型凝膠成像系統(tǒng)，北京六一儀器廠；顯微鏡，日本Nikon E 公司；CUT4062 型石蠟切片機(jī)、包埋機(jī)，德國SLEE 公司。

1.3 大鼠造模及給藥方法

王會林［7］采用Longa 改良線栓法建立非心源性缺血性腦卒中模型：使用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉（劑量為5 mL·kg-1），麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺，75%酒精消毒大鼠左頸部皮膚和手術(shù)器械后，剪開大鼠左頸部皮膚，鈍性分離頸部肌群、頸外動脈（external carotid artery，ECA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）和頸總動脈（common carotid artery，CCA），用手術(shù)線于頸內(nèi)動脈和頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，并用動脈夾夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈，自頸總動脈結(jié)扎處1 cm 用注射器針頭刺開一小口，將一端燒圓的魚線自頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，深入至左側(cè)大腦中動脈起始部位至感受到阻力阻斷供血為止，插入深度可達(dá)18 mm，扎緊手術(shù)線縫合傷口，并消毒防止大鼠出現(xiàn)感染。假手術(shù)組僅將無燒圓的線栓的魚線深入頸內(nèi)動脈5 mm，其余步驟同模型組。造模成功后，阿托伐他汀組大鼠連續(xù)灌胃阿托伐他汀（1 mg·kg-1·d-1）2 w，假手術(shù)組和模型組連續(xù)灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液2 w。

1.4 神經(jīng)功能缺損評估

給藥結(jié)束后2 d，康瑜等［8］觀察各組大鼠神經(jīng)功能缺損評估：無明顯神經(jīng)功能缺損可自由活動，記為0 分；線栓堵塞對側(cè)的前爪無法完全伸直為1 分；行走時(shí)向線栓堵塞對側(cè)無法控制的旋轉(zhuǎn)為2 分；向線栓堵塞對側(cè)無法控制傾倒為3 分；無法自主活動，失去意識為4 分。得分越高，大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5 取材

大鼠神經(jīng)功能缺損評估結(jié)束后，脫臼處死大鼠，迅速斷頭取腦，取左側(cè)大腦半球，分為兩部分保存，一部分放置于4%多聚甲醛中固定24 h 后，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋和切片，用于HE 染色和末端標(biāo)記（TUNEL）染色；另一部分放置于-80℃超低溫冰箱保存，用于Western blotting 實(shí)驗(yàn)。

1.6 各組大鼠腦組織病理切片和神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化

腦組織切片后取一份HE 染色封片后顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理變化，并取5 個(gè)不同視野拍照；另取一份用于TUNEL 染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，顯微鏡下觀察并取5 個(gè)不同視野拍照。并對視野下凋亡神經(jīng)元和總神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算兩者比值為細(xì)胞凋亡率。

1.7 血清炎癥因子水平檢測

取大鼠動脈血，4 000 r·min-1離心10 min 后取血清，酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行血清炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平檢測，嚴(yán)格遵照說明書操作。

1.8 Western blotting 法觀察各組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取受損腦皮層組織50 mg，勻漿裂解提取總蛋白，測定蛋白濃度，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，電泳；進(jìn)行免疫反應(yīng)：封閉，孵育一抗，洗滌，孵育二抗，洗滌；用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對信號進(jìn)行評價(jià)，以檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白TLR4、NF-κB p65、p-IκB 和Cleaved Caspase-3 的表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 版軟件進(jìn)行分析，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異用t檢驗(yàn)，率的比較用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠神經(jīng)功能缺損評估比較

神經(jīng)功能缺損評估結(jié)果如Tab.1 顯示，模型組（2.79±0.35）分和阿托伐他汀組（1.71±0.25）分得分較假手術(shù)組（0.23±0.04）分明顯為高（P＜0.05）；而阿托伐他汀組較模型組得分明顯為低（P＜0.05）。

Tab.1 Effect of atorvastatin on nerve function in rats with non -cardiac ischemic stroke

2.2 HE 染色病理切片觀察阿托伐他汀對非心源性缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷的影響

HE 染色病理切片的結(jié)果顯示（Fig.1），假手術(shù)組大鼠腦組織未見明顯病理改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組細(xì)胞組織之間有明顯的間隙，有神經(jīng)元變性且排列紊亂；阿托伐他汀組神經(jīng)元排列和神經(jīng)元之間的空隙明顯較模型組改善，表明腦組織損傷較模型組減輕。

Fig.1 Observation of brain histopathology differences in rats with HE staining

2.3 TUNEL 染色觀察阿托伐他汀對非心源性缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL 染色結(jié)果如Fig.2 顯示，模型組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯，凋亡率為（49.25±9.21）%，阿托伐他汀組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡較輕，凋亡率為（33.73±8.27）%，二者神經(jīng)元凋亡率較假手術(shù)組（13.28±3.14）%明顯增高（P＜0.05）；而阿托伐他汀組較模型組神經(jīng)元凋亡率明顯降低（P＜0.05）。

Fig.2 Apoptosis of neurons in brain tissue of rats with TUNEL staining

2.4 阿托伐他汀對非心源性缺血性腦卒中大鼠血清炎癥因子水平的影響

如Tab.2 所示，模型組和阿托伐他汀組IL-6、TNF-α和IL-1β水平較假手術(shù)組明顯增高（P＜0.05）；而阿托伐他汀組較模型組IL-6、TNF-α和IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。

Tab.2 Effect of atorvastatin on serum inflammatory factor levels in non-cardiac ischemic stroke rats

2.5 阿托伐他汀對非心源性缺血性腦卒中大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

如Fig.3、Tab.3 所示，模型組和阿托伐他汀組TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)（P＜0.05）；而阿托伐他汀組TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)較模型組明顯下調(diào)（P＜0.05）。

Tab.3 Effects of atorvastatin on TLR4、NF-κB p65、p-IκB、Cleaved Caspase-3 protein expression in brain tissue of non-cardiac ischemic stroke rats

Fig.3 Effects of atorvastatin on TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 protein expression in brain tissue of non-cardiac ischemic stroke rats.

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，心腦血管疾病的研究有了很大進(jìn)展，然而缺血性腦卒中致死率致殘率仍然居高不下，且目前尚無普遍適用的治療方法［9］。缺血性腦卒中患者常伴有認(rèn)識、感覺及運(yùn)動功能障礙，臨床表現(xiàn)為偏癱、神經(jīng)功能癥狀、語言和記憶障礙。

阿托伐他汀鈣是臨床使用最廣泛的HMG-CoA 還原酶抑制劑，可抑制膽固醇的生成，降低血脂，是缺血性腦血管病的二級預(yù)防藥物。近年來，有報(bào)道HMGCoA 還原酶抑制劑（他汀類藥物）可通過調(diào)控脂質(zhì)代謝緩解腦部血流狀況來有效減輕腦梗死患者的神經(jīng)功能缺陷，保護(hù)腦組織，改善神經(jīng)功能［10］。本文結(jié)果證實(shí)阿托伐他汀鈣可顯著改善神經(jīng)功能障礙，抑制非心源性缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

有研究報(bào)道神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，IL-6、TNF-α和IL-1β是臨床常見的炎癥因子，可有效反映患者的炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度［4，11］。本研究中，阿托伐他汀組IL-6、TNF-α和IL-1β較模型組明顯降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡的狀況較模型組也得到明顯改善，表明阿托伐他汀可抑制IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生，以減輕對神經(jīng)細(xì)胞的傷害，抑制細(xì)胞凋亡，使缺血性腦卒中的療效更好。

楊曉煒等［12］的研究顯示阿托伐他汀可通過下調(diào)TLR4/NF-κB 通路減少TNF-α等炎癥因子的生成釋放。另外，I κB 激活磷酸化生成p-I κB，可釋放NF-κB p65，也可增加IL-6、TNF-α和IL-1β的釋放，使炎癥反應(yīng)加?。?3］。本研究Western blotting 免疫印跡結(jié)果顯示阿托伐他汀可明顯下調(diào)TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 的表達(dá)，與已有的研究結(jié)果吻合。

綜上，阿托伐他汀鈣能夠抑制TLR4 和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65 的表達(dá)，通過該途徑抑制非心源性缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能障礙。