詹旭莉 湯建華

河北北方學院附屬第一醫(yī)院藥學部，張家口，075000，中國

隨著 20 世紀30 年代磺胺類藥物的臨床應(yīng)用，開啟了抗微生物治療的新時代，抗生素成為治療細菌感染的有效武器。當細菌接觸到抗菌藥物，會自發(fā)地改變自身代謝途徑或產(chǎn)生相應(yīng)的滅活物質(zhì)抵抗抗菌藥物，從而產(chǎn)生耐藥性。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌為革蘭氏陰性菌，常位于人體上呼吸道和腸道，引起呼吸道感染、尿路感染和血流感染［1］，是引起醫(yī)院獲得性肺炎的一個原因，且引起感染的多樣性和流行病學發(fā)生的巨大變化，給臨床治療與預后帶來困難，是臨床分離和醫(yī)院感染的重要致病菌之一。自2009 年在印度發(fā)現(xiàn)產(chǎn)Ⅰ型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）（被稱為超級細菌）至今，美國、德國、日本、澳洲等多個國家和地區(qū)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該種超級耐藥細菌，呈全球蔓延趨勢［2-4］。我國“全國細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)”的數(shù)據(jù)表明，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）檢出率也呈逐年上升趨勢，從2014 年6.4% 上升至2019 年10.9%［5］。其中河南省的CRKP 的檢出率最高，為53.01%，上海、浙江、江蘇、湖北、山西各地檢出率達30%以上，現(xiàn)狀不容樂觀［6］。因此，了解CRKP 的耐藥機制對于今后指導臨床合理用藥越來越重要［7］。

目前臨床上使用的抗菌藥物，主要包括β-內(nèi)酰胺類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類及林可霉素類抗生素、氨基糖苷類及多肽類抗生素、四環(huán)素類及氯霉素類抗生素、人工合成類抗生素，均在提高患者生存率、緩解癥狀和改善生活質(zhì)量方面發(fā)揮了巨大作用。然而，近年來隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌對藥物產(chǎn)生的耐藥性也逐年上升。Pulzova 等的研究結(jié)果揭示該菌的耐藥機制有很多，包括產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）、由孔蛋白丟失導致的細菌外膜滲透性改變、主動外排系統(tǒng)表達活躍、產(chǎn)生生物被膜等［8］?，F(xiàn)就CRKP 的耐藥作用機制分類進行闡述。

1 產(chǎn)碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是指能夠明顯水解亞胺培南或美羅培南的一類β內(nèi)酰胺酶，根據(jù)Ambler 分子分類可分為A、B、D 的3 類酶，包括陰溝腸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌中由染色體介導的NMC、SME、IMI 酶，以及肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒介導的KPC 酶、銅綠假單胞菌中GES 酶，居泉沙雷菌的SFC 酶。KP 主要產(chǎn)生被稱為 A 類的絲氨酸酶［9］，介導高水平耐藥。B 類酶常見的酶型有IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM 等。OXA-48 是D 類酶檢出最多的一種，其活性部位具有絲氨酸結(jié)構(gòu)，對亞胺培南的水解能力很強，比OXA-23、OXA-24、OXA-58等其他OXA 型酶高10 倍，同時攜帶OXA-48 及其他碳青霉烯酶的KP 表現(xiàn)出更高的耐藥水平［10］。此外，碳青霉烯酶通常與許多其他耐藥決定因素相關(guān)，導致多重耐藥。

1.1 A 類碳青霉烯酶

A 類碳青霉烯酶以絲氨酸殘基為活性位點，其中KPC 酶與CRKP 耐藥性密切相關(guān)，產(chǎn)KPC 酶的細菌對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類等多種抗生素耐藥，是目前腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制。已發(fā)現(xiàn)的KPC 包括KPC-1 至KPC-19 在內(nèi)的19 種KPC，其中以KPC-2 和KPC-3 最為常見，能夠水解除氨曲南以外的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素［11］，推動了大流行性醫(yī)院暴發(fā)性克隆肺炎克雷伯菌ST258的傳播［12］。雖然KPC 酶只能引起KP 對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥，但有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生KPC 酶的KP 可能存在異質(zhì)性耐藥。在抗菌藥物的選擇性壓力下，可快速誘導高水平碳青霉烯耐藥性，其高水平耐藥與抗菌藥物篩選出膜孔蛋白基因OmpK36 缺乏的菌株后協(xié)同KPC 有關(guān)［13］。同時KPC 基因能夠憑借質(zhì)粒傳播，使其在不同菌株和菌種間擴散，降低抗感染治療的成功率。為了避免廣譜抗生素的過度使用，仔細選擇可接受經(jīng)驗性治療的患者至關(guān)重要［14］。此外，在接受頭孢他啶-阿維巴坦治療的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了耐藥突變體。產(chǎn)生KPC-2 或KPC-3 的KP 分離株在治療后10～19 天內(nèi)出現(xiàn)耐藥性，與KPC 酶（R164 至D179）的ω環(huán)突變有關(guān)［11，15］。最常見的突變是氨基酸位置179（D179Y）的天冬氨酸被酪氨酸取代［16］。這些突變導致頭孢他啶水解增強，而阿維巴坦完全抑制這種水解，導致對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性下降。另外KPC 陽性的KP 外膜通透性降低，使其對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥程度增強。但Tolentino 等人的研究報道KPC 可與其他耐藥基因共同存在同一株細菌而產(chǎn)生高水平耐藥，所以需結(jié)合檢測菌株的遺傳背景進行耐藥分析［17］。

1.2 B 類碳青霉烯酶

B 類碳青霉烯酶具有獨特的水解二價陽離子（最常見的是Zn2+）的機制，主要包括新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（new delhi metallo-β-lactamase，NDM），碳青霉烯酶的IMP 系列，以及維羅納整合子編碼的金屬β-內(nèi)酰胺酶（VIM）。攜帶NDM-1 基因的細菌具有極強的耐藥性，對所有的抗菌藥物幾乎都有抗藥性。NDM-1 的活性位點具有特殊功能，其獨特的氨基酸殘基的立體折疊結(jié)構(gòu)能夠與碳青霉烯藥物獲得更加緊密的結(jié)合，使其耐藥性更強［18］。到2010 年，NDM-1 已在大腸桿菌的染色體內(nèi)被檢測到［19］，而且這種基因還有可能通過“基因水平轉(zhuǎn)移”這一機制在不同種類的細菌間傳遞，從而使得其他細菌也可以獲得這種基因，產(chǎn)生相同的耐藥性［20］。這些酶水解多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，但不能水解單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，如氨曲南。

我們發(fā)現(xiàn)所有NDM-1 基因都可以通過轉(zhuǎn)化和接合成功轉(zhuǎn)移，而KPC-2 基因的轉(zhuǎn)移僅通過接合。對這一發(fā)現(xiàn)最合理的解釋是，NDM-1 攜帶可自我傳播的IncA/C 或IncP 質(zhì)粒，而KPC-2 位于非自我傳播的質(zhì)粒上或染色體上［21］。

1.3 D 類碳青霉烯酶

D 類為青霉素酶，對青霉素的水解效率很高，但對碳青霉烯類的水解能力較弱，且不含廣譜頭孢菌素，其中 OXA-48 與碳青霉烯類耐藥密切相關(guān)。目前為止，在非洲、中東和歐洲，特別是在地中海地區(qū)，已經(jīng)清楚地記錄了含OXA-48 的病原體的逐漸擴散對世界其他地方是一個巨大的威脅［22］，且報道逐漸增多。據(jù)報道，在2014～2015 年期間，這些菌株在土耳其的數(shù)量很多［23］。92%的腸桿菌科耐藥是由OXA-48 引起的?？赡苁怯捎诋a(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株活化或改變了 OXA-48 的表達，產(chǎn) OXA-48 菌株對碳青霉烯類藥物的敏感性降低，也可能是由于外膜通透性降低，從而對碳青霉烯類藥物具有一定的水解活性［24］。OXA-48 基因的傳播主要與62 kb 的單個IncL/M 型自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的傳播有關(guān)［25］。單獨的OXA-48 樣碳青霉烯酶可誘導較弱的青霉素和碳青霉烯水解，但不會誘導頭孢菌素。因此，它們可能更難檢測，并被稱為“幻影威脅”。當發(fā)現(xiàn)這些酶與其他β-內(nèi)酰胺酶（如ESBL）結(jié)合使用或當孔蛋白變化導致通透性降低時，可能發(fā)生高水平的碳青霉烯抗性。

2 外膜孔蛋白的缺失

外膜孔蛋白是一種存在于革蘭陰性菌細胞外膜的脂多糖層上的水溶性擴散通道，主要包括OmpK35、OmpK36?？股乜赏ㄟ^這些孔道進入細菌體內(nèi)發(fā)揮抗菌作用。染色體上主要外膜孔蛋白OmpK35 和OmpK36 的修飾可降低外膜對藥物的滲透性，限制了作用于CRKP 的抗生素透過外膜的流入［26］。這是通過插入胞嘧啶核苷酸推斷出來的，這會導致翻譯移碼，從而在第89 位密碼子截斷蛋白質(zhì)。外膜孔蛋白缺陷降低了對β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性，并與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合，抗生素無法通過這些孔道進入細菌體內(nèi)，進而降低了抗菌藥物的敏感性，從而出現(xiàn)耐藥性［27］。OmpK36孔蛋白的缺失會顯著影響KP 的代謝適應(yīng)性，較慢的生長速度可能會使其更容易被免疫系統(tǒng)在體內(nèi)消除［28］。

Turner 等的研究表明，在感染期間，OmpK36 主要在炎癥反應(yīng)中起作用［29］。遺傳多態(tài)性顯示KP 分離株可分為4（A、B、C 及D 型）個主要的OmpK36 孔蛋白變異體［30］。并且，在這4 種分型中，C 型分離株比非C組分離株具有更高的高粘血癥發(fā)生率，因此C 組最有可能與黏液樣分離株相關(guān)，主要包括莢膜血清型為K1、K2 和K5 分離株，以及大多數(shù)K57 分離株。然而K20血清型在OmpK36 非C 組分離株中比在OmpK36 C組分離株中更普遍［28］。OmpK36 C 組分離株對幾乎所有抗菌藥物的耐藥率明顯低于OmpK36 組非C 組分離株。

3 外排泵作用的增強

外排泵存在于幾乎所有的細菌的染色體上，并且通過促進位點突變和改變膜的通透性，降低細胞內(nèi)抗生素濃度進而產(chǎn)生耐藥［31］。外排泵系統(tǒng)的表達是該菌產(chǎn)生耐藥性的重要機制之一。目前為止，發(fā)現(xiàn)7 類細菌藥物外排泵［32］。Sheng 等的研究報告表明，外排泵的表達增加，例如AcrAB 和OqxAB 在替加環(huán)素治療KP 的抗性機制中發(fā)揮重要作用［33］。已證實AcrAB外排泵受RamA 和SoxS 調(diào)節(jié)，OqxAB 受RamA 和RarA 調(diào)節(jié)，KP 的外膜蛋白TolC 受所有這些調(diào)節(jié)物控制［34］。

3.1 AcrAB-TolC 外排泵

AcrAB-TolC 復合體主要由外膜通道蛋白TolC、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白AcrB 和膜融合蛋白AcrA 組成［35］。有研究報告證實，轉(zhuǎn)運蛋白能從細胞周質(zhì)或者從細胞質(zhì)膜外層直接捕獲底物，融合蛋白通過連接外層通道和內(nèi)層泵進行外排［36］，當細菌中轉(zhuǎn)運蛋白過量表達時，細菌就會通過物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵將抗生素排出。其中AcrABTolC 系統(tǒng)與青霉素和頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性有關(guān)，AcrAB 外排泵的過度表達是導致某些菌株對抗生素敏感性下降的原因［37］，如厄他培南和美羅培南。AcrAB 能夠識別多種底物（喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素和β內(nèi)酰胺類等多種抗菌藥物），這些抗生素與TolC 結(jié)合可增強細菌對抗生素的外排作用［38］。

AcrAB-TolC 泵可由RamA、SoxS、RarA 等基因激活。RamA 是AcrAB-TolC 外排泵轉(zhuǎn)運蛋白的激活劑，通過調(diào)節(jié)外排泵以增強KP 對β-內(nèi)酰胺類藥物的抗性，其過表達還能導致靶位點的突變或孔蛋白的丟失以致KP 產(chǎn)生耐藥［39］。RamA 不僅可以降低KP 對替加環(huán)素的敏感性，還能促進AcrA 過表達以增強對氟喹諾酮的耐藥性［40］。與RamA 一樣，SoxS 的過量表達與編碼外排泵AcrAB 基因的轉(zhuǎn)錄水平增加有關(guān)，從而提高對頭孢西丁、喹諾酮類藥物和氯霉素的耐藥性［34］。RarA 通過上調(diào)AcrAB、AcrCD 和AcrEF 外排泵和下調(diào)OmpF孔蛋白賦予肺炎克雷伯菌耐藥性。通過比較過量表達RamA、SoxS、RarA 這3 種調(diào)節(jié)因子對包膜通透性、外排泵和孔蛋白產(chǎn)生以及KP 的抗生素敏感性的相對影響，發(fā)現(xiàn)RamA 是KP 中最有效的包膜通透性調(diào)節(jié)劑，其次是RarA，最后是SoxS［34］。負向調(diào)節(jié)因子RamR、SoxR、AcrR 通過下調(diào)AcrAB 的表達以恢復KP 對藥物的敏感性。RamA 的阻遏基因RamR 參與了KP 中AcrAB 表達的調(diào)節(jié)，通過抑制AcrB 和RamA 的過度表達，恢復KP 對替加環(huán)素的敏感性［41］。而SoxR 基因能抑制SoxS 的過度表達，因此，RamR 和SoxR 基因調(diào)控KP 外排系統(tǒng)的表達［42］。導致AcrAB 外排系統(tǒng)過度表達的原因是AcrR 密碼子45 位氨基酸突變，精氨酸取代半胱氨酸，并導致多重耐藥［43］?？偟膩碚f，RamA、SoxS、RarA 參與了抗生素敏感性的改變，并導致新陳代謝和細菌適應(yīng)性的變化。

3.2 RamA-OqxAB 外排泵

RamA 是調(diào)節(jié)抗生素敏感性最重要的基因。OqxAB 是近幾年發(fā)現(xiàn)的KP 固有的一種較新的外排泵系統(tǒng)，對多種不同類別的底物都能表現(xiàn)出一定的外排作用［44］。OqxAB 基因的過度表達導致對多種藥物（喹諾酮、替加環(huán)素、呋喃妥因和氯霉素）、洗滌劑和消毒劑產(chǎn)生耐藥性［45］。RarA 的過表達可以上調(diào)其下游外排泵操縱子OqxAB 和AcrAB 的表達水平［46］。在KP 臨床分離株的OqxR 上發(fā)現(xiàn)的一個新的氨基酸替代物也能誘導OqxAB 和RarA 的高表達［47］。這種質(zhì)粒攜帶的多藥外排泵可能會造成耐藥性問題，因為它可能會促進多種藥物的耐藥性發(fā)展，并通過水平轉(zhuǎn)移傳播耐藥性。

4 生物被膜

生物被膜是細菌附著在生物材料表面，由于過度生長而形成的細菌復合體，是非特異性細菌耐藥機制之一。主要成分包括細菌及其分泌的多糖基質(zhì)、脂蛋白等。CRKP 生物膜的發(fā)展經(jīng)歷了四個階段，分別是細胞的黏附、菌落的形成、成熟以及最終繁殖成為自由生存的細胞。參與形成過程最重要的表面結(jié)構(gòu)是Ⅲ型菌毛和莢膜多糖［48］。菌毛介導穩(wěn)定的黏附，而莢膜多糖最終影響生物膜的結(jié)構(gòu)和細胞間的通訊。生物膜形成的過程中，受到動力學和環(huán)境變化的刺激，細菌必須具有迅速而廣泛地改變基因表達的能力［48］。CRKP 的某些特定基因的突變也會影響生物膜的功能。Mostafavi等人發(fā)現(xiàn)fabZ 和IpxC 突變導致IpxC 抑制劑依賴的細菌生長，從而導致生物膜穩(wěn)態(tài)喪失［49］。Hsieh 等報道YfgL（BamB）脂蛋白參與CRKP 的生物膜形成過程和Ⅰ型菌毛的轉(zhuǎn)錄表達，這對于體內(nèi)CRKP 的抗吞噬作用至關(guān)重要［50］。此外，Saurel 等的報道，發(fā)現(xiàn)CRKP 的外膜蛋白A（KpOmpA）參與細黏附和細胞間識別以及宿主的免疫反應(yīng)，且表面的L3 位點可能與CRKP 的致病性有關(guān)［51］。氧化應(yīng)激可能氧化并破壞CRKP 的生物膜，導致主要膜蛋白的缺失［52］。上述相關(guān)研究表明，CRKP 的生物膜是維持其活性的關(guān)鍵條件之一。

細菌一旦形成生物被膜，則會增加活菌對機體的免疫并產(chǎn)生抗生素耐藥，這直接提升了膜內(nèi)細菌的存活率。CRKP 的生物被膜只有氨芐西林和環(huán)丙沙星兩種抗菌藥物能通過，碳青霉烯類抗菌藥物通透性差。對CRKP 浮游菌和生物被膜細菌同時進行滅菌，最終細菌消滅率分別為91%～93.5%和25%～26%。

5 結(jié)論

綜上所述，CRKP 因具有多種基因結(jié)構(gòu)和復雜的耐藥機制而在全球范圍內(nèi)廣泛傳播并呈增加趨勢。耐藥基因可通過細菌間的質(zhì)?；蛉旧w進行水平或垂直傳播，大大增加了檢測的難度。因此需要臨床微生物實驗室構(gòu)建成熟完備的耐藥基因檢測系統(tǒng)，以便及時準確地反饋信息并制定合理的給藥方案。復雜的耐藥機制導致CRKP 對常用抗菌藥物產(chǎn)生廣泛耐藥，臨床常常面臨無藥可選的窘境。臨床治療藥品品種有限，上市的新藥頭孢他啶聯(lián)合阿維巴坦治療經(jīng)驗有限，治療費用昂貴，大部分人不可獲得，限制了其廣泛應(yīng)用，導致該類細菌感染患者陷入無藥可用的困境。近年來，使用雙碳青霉烯類聯(lián)合治療CRKP 成為一個新的方向，其原理是利用一種碳青霉烯類藥物結(jié)合耐藥基因，另外一種碳青霉烯類藥物發(fā)揮抗菌作用。目前還處于基礎(chǔ)研究階段，已經(jīng)取得了一定成果。