孫琦，何芳，邵勝楠，劉政，黃家風(fēng)

棉花黃萎病菌的克隆及功能分析

孫琦，何芳，邵勝楠，劉政，黃家風(fēng)

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003）

【】明確棉花黃萎病菌（大麗輪枝菌）中一個(gè)新基因（）的功能，為解析棉花黃萎病菌的致病機(jī)制以及棉花黃萎病的防治提供依據(jù)。以大麗輪枝菌野生型菌株V592的基因組DNA和cDNA為模板，對(duì)全長進(jìn)行克隆并測(cè)序；利用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分別對(duì)棉花根系誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)量及V592菌株不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定；構(gòu)建針對(duì)的敲除載體、互補(bǔ)載體和過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化篩選基因敲除突變體、互補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株；以野生型菌株V592為對(duì)照，對(duì)基因敲除突變體及互補(bǔ)菌株的菌落及菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察，并對(duì)微菌核量、產(chǎn)孢量及致病力進(jìn)行測(cè)定；通過RT-qPCR測(cè)定其他致病力相關(guān)的基因在基因敲除突變體及過表達(dá)體菌株中的表達(dá)情況。全長為862 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白含268個(gè)氨基酸，與GenBank中已注釋的基因沒有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系誘導(dǎo)6—12 h時(shí)表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明在大麗輪枝菌侵染早期發(fā)揮作用。在分生孢子中的表達(dá)量顯著高于在菌絲和微菌核中的表達(dá)量，表明在大麗輪枝菌不同組織中的表達(dá)具有差異性。與野生型菌株V592相比，基因敲除突變體產(chǎn)孢量和產(chǎn)孢梗顯著減少，菌絲分支呈螺旋狀，對(duì)棉花的致病力明顯下降。與侵染釘形成相關(guān)基因（、、）、分泌蛋白釋放相關(guān)基因（）及分生孢子產(chǎn)生相關(guān)基因（、、、、、、）在基因敲除體中的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，在過表達(dá)菌株中上調(diào)；而與黑色素合成相關(guān)基因（、、、）在基因敲除突變體中則顯著上調(diào)，在過表達(dá)菌株中下調(diào)。與大麗輪枝菌分生孢子和產(chǎn)孢梗的產(chǎn)生有關(guān)，參與大麗輪枝菌致?。粚?duì)與侵染釘形成、分泌蛋白釋放及分生孢子產(chǎn)生相關(guān)基因的表達(dá)具有正調(diào)控作用，對(duì)黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

棉花黃萎??；大麗輪枝菌；；產(chǎn)孢；致病力；轉(zhuǎn)錄表達(dá)

0 引言

【研究意義】棉花黃萎?。╟otton verticillium wilt）是威脅我國棉花生產(chǎn)的一種重要土傳病害，由大麗輪枝菌（）引起[1]。目前有關(guān)該病原菌致病機(jī)制的解析尚不全面，加之其特殊的存活方式，黑色微菌核可在土壤中存活多年，使得依賴傳統(tǒng)方法進(jìn)行防治難以奏效[2]。因此，通過基因功能鑒定找到調(diào)控大麗輪枝菌致病機(jī)制的關(guān)鍵因子，對(duì)全面解析大麗輪枝菌致病機(jī)制，以及利用靶基因進(jìn)行棉花抗病育種和探索新型防治方法具有重要的理論價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來有關(guān)大麗輪枝菌致病相關(guān)基因及致病機(jī)制的研究取得了較大進(jìn)展，大致分成4種情況：第1類基因編碼效應(yīng)子蛋白，通過干擾或阻止植物免疫過程參與致病，如編碼的聚多糖脫乙酰酶，通過對(duì)真菌細(xì)胞壁組分幾丁質(zhì)寡糖進(jìn)行脫乙酰作用，阻止幾丁質(zhì)寡糖觸發(fā)免疫信號(hào)傳遞，進(jìn)而抑制寄主的免疫反應(yīng)[3]；編碼的分泌蛋白直接作用于調(diào)節(jié)植物免疫的轉(zhuǎn)錄因子以阻止植物的免疫反應(yīng)[4]；此類效應(yīng)子蛋白還有VdNLP1、VdNLP2[5-6]和VdCUT11[7]。第2類基因通過形成侵入結(jié)構(gòu)或分泌結(jié)構(gòu)參與致病，如和編碼的蛋白復(fù)合體定位于附著枝細(xì)胞膜，通過促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)活性氧和鈣離子的積累激活VdCrz1轉(zhuǎn)錄因子及鈣離子信號(hào)途徑，從而調(diào)控附著枝分化形成侵染釘，/基因敲除導(dǎo)致附著枝不能形成侵染釘，進(jìn)而使大麗輪枝菌喪失致病力[8]；VdSep5蛋白在侵染釘與其侵入寄主后的侵染性菌絲之間形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即在大麗輪枝菌與寄主互作界面形成菌絲頸環(huán)用于分泌蛋白的釋放和輸出[9]。第3類基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，這類基因通常不僅影響致病力，也參與大麗輪枝菌的產(chǎn)孢、微菌核（或黑色素）形成，如轉(zhuǎn)錄因子基因和敲除后分別影響大麗輪枝菌的穿透能力和在寄主體內(nèi)的定殖，并導(dǎo)致大麗輪枝菌產(chǎn)孢量下降、微菌核減少，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SOM1和VTA3共同調(diào)控與產(chǎn)孢、微菌核形成及毒力相關(guān)基因的表達(dá)[10]；Vdpf轉(zhuǎn)錄因子通過cAMP依賴信號(hào)途徑和G蛋白信號(hào)途徑調(diào)控大麗輪枝菌黑色素形成、并且還通過調(diào)控與產(chǎn)孢及毒力相關(guān)基因的表達(dá)影響大麗輪枝菌的致病力和產(chǎn)孢量[11]；此類轉(zhuǎn)錄因子還有VdSge1、VdCmr1、VdHapX等[12-14]。第4類基因通過信號(hào)途徑參與大麗輪枝菌致病，同時(shí)也參與分生孢子、微菌核或黑色素的形成過程，如MAPK信號(hào)途徑中編碼的跨膜蛋白與Vst50-Vst7-Vst11蛋白模塊共同調(diào)控大麗輪枝菌黑色素形成和穿透能力，黑色素含量與大麗輪枝菌的穿透能力密切相關(guān)[15]；此外，該信號(hào)途徑中的、、分別敲除均導(dǎo)致大麗輪枝菌致病力下降并伴隨產(chǎn)孢量下降和微菌核減少[16-18]；又如和分別通過cAMP依賴信號(hào)途徑和G蛋白信號(hào)途徑對(duì)大麗輪枝菌的致病力、產(chǎn)孢量和微菌核形成產(chǎn)生影響[19-20]。綜上所述，參與大麗輪枝菌致病的基因很多，致病機(jī)制復(fù)雜，各基因參與的途徑之間相互作用，共同決定了大麗輪枝菌對(duì)寄主的致病作用。【本研究切入點(diǎn)】筆者課題組從前期已構(gòu)建的大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫中篩選到一株致病力顯著下降的突變菌株，通過鑒定發(fā)現(xiàn)，被插入突變的基因是VDAG_07100基因，其預(yù)測(cè)編碼蛋白（hypothetical protein）沒有功能注釋，因此將其命名為。除了影響大麗輪枝菌的致病力外，其他生物學(xué)功能尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】從大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株V592中克隆，并對(duì)在棉花根誘導(dǎo)條件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行分析；通過獲得的敲除突變體菌株、互補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株，研究該基因?qū)Υ篼愝喼L發(fā)育、致病力及對(duì)其他致病相關(guān)基因的影響，明確的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年6月至2019年8月在新疆石河子大學(xué)新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大麗輪枝菌V592菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。p克隆載體購自TaKaRa公司。敲除載體p和過表達(dá)載體p由中國科學(xué)院微生物研究所郭惠珊研究員惠贈(zèng)?；パa(bǔ)載體p由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 植物材料 棉花品種為感病品種軍棉1號(hào)。

1.2 VdHP1的克隆與測(cè)序

參考宋雯等[21]的方法，利用真菌DNA提取試劑盒（BioFlux）及Trizol（QIAGEN）法分別提取V592菌株的DNA和RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)大麗輪枝菌VdLs.17菌株的VDAG_07100基因序列（NCBI），設(shè)計(jì)引物full-F（5′-ATGCGTTTCTTCGCCTTTTT-3′）和full-R（5′-TAGTCCATTCTGATCCATGT-3′），分別以V592的DNA和cDNA為模板擴(kuò)增的全長和CDS序列并測(cè)序。

1.3 VdHP1在大麗輪枝菌中的表達(dá)

1.3.1 棉花根誘導(dǎo)條件下的表達(dá) 挑選粒大飽滿的軍棉1號(hào)種子，剝?nèi)シN皮后置于0.1%的升汞溶液中消毒處理30 min，用清水漂洗3遍，放入裝有40 mL MS培養(yǎng)基的三角瓶中，暗培養(yǎng)7 d。待根長至5—10 cm時(shí)剪取2 g棉花根段，添加至100 mL Czapek-Dox液體培養(yǎng)基中；再將PDA上培養(yǎng)7 d的V592菌株，取10個(gè)直徑1 cm的菌餅加入，分別在26℃、200 r/min培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、24和48 h；分別以未加棉花根系在同樣條件下培養(yǎng)的V592菌株為陰性對(duì)照；剔除棉花根段，參照方法1.2，提取各菌株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；按照SYBR（Life Technologies）試劑盒說明添加樣品，通過qPCR反應(yīng)分析受棉花根系誘導(dǎo)后的表達(dá)特征。qPCR反應(yīng)在7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Life Technologies）中完成，以作為內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，每種菌株設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，根據(jù)2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，再利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2在大麗輪枝菌不同組織中的表達(dá) 參考王春巧等[22]的方法，分別收集V592菌株的菌絲體、分生孢子和微菌核，提取各組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用上述qPCR方法分析在不同組織中的表達(dá)情況。

1.4 載體構(gòu)建及真菌轉(zhuǎn)化

構(gòu)建針對(duì)的敲除載體，先用引物up-F和up-R從V592菌株的基因組中擴(kuò)增基因上游780 bp片段，再用引物down-F和down-R從V592基因組DNA中擴(kuò)增基因下游782 bp片段。將獲得的2個(gè)目標(biāo)片段與Ⅰ線性化的敲除載體通過多片段重組酶（Vazyme）進(jìn)行重組構(gòu)建敲除載體p，再將其通過ATMT方法轉(zhuǎn)化V592菌株的分生孢子。將獲得的轉(zhuǎn)化子參考Wang等[23]的PCR方法進(jìn)行初步篩選。再分別用的特異引物U和L，及的特異引物full-F和full-R對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行再次篩選。為了獲得互補(bǔ)菌株，用引物EC-F和EC-R從V592菌株的基因組DNA中擴(kuò)增基因編碼區(qū)全長，將其插入到I/H I線性化的互補(bǔ)載體中，通過ATMT轉(zhuǎn)化基因敲除突變體，對(duì)轉(zhuǎn)化子用抗生素G418和PCR方法進(jìn)行篩選。為了獲得基因過表達(dá)菌株，用引物對(duì)OE-F和OE-R從V592菌株中擴(kuò)增基因編碼區(qū)全長，插入到I/I線性化的p載體中。然后通過ATMT方法將該載體轉(zhuǎn)化V592菌株。最后，用引物-qPCR-F和-qPCR-R通過RT-qPCR對(duì)目標(biāo)基因在野生型菌株、敲除突變體菌株、互補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行確定。載體構(gòu)建所用引物見表1。

表1 載體構(gòu)建所用引物

1.5 VdHP1基因敲除突變體生物學(xué)性狀的測(cè)定

基因敲除突變體的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量及微菌核產(chǎn)量參考宋雯等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定；菌絲的顯微觀察：將真菌在PDA平板上劃線，再將滅菌的蓋玻片斜插到劃好的線上，26℃暗培養(yǎng)3 d，取出蓋玻片在顯微鏡下觀察菌絲生長情況。玻璃紙穿透試驗(yàn)：參考Zhao等[8]的方法將滅菌玻璃紙平鋪在MM基本培養(yǎng)基上，用牙簽挑取菌絲接種至玻璃紙中央，分別培養(yǎng)3、4、5、6和7 d揭去玻璃紙，繼續(xù)培養(yǎng)7 d觀察真菌穿透玻璃紙后的菌落形成情況。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.6 致病力測(cè)定

將棉苗在MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至4—5片真葉展開時(shí)[21]，參照Gao等[24]的無傷浸根接種法用濃度為1×107cfu/mL的孢子懸浮液進(jìn)行接種，每個(gè)菌株接種3個(gè)營養(yǎng)缽，每個(gè)營養(yǎng)缽12棵棉苗。參考Zhang等[25]的方法進(jìn)行病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.7 利用qPCR測(cè)定感病植株中真菌生物量

對(duì)接種28 d的棉花分別提取根、莖、葉的總DNA，通過qPCR測(cè)定其中大麗輪枝菌的生物量。qPCR所用引物ITS-F和ITS-R基于核糖體RNA的ITS1和ITS2區(qū)設(shè)計(jì)[25]。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。qPCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)處理與同1.3.1。

1.8 其他致病相關(guān)基因在VdHP1基因敲除突變體中的表達(dá)量測(cè)定

通過RT-qPCR對(duì)大麗輪枝菌其他致病相關(guān)基因在野生型菌株V592、敲除突變體和互補(bǔ)菌株中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定。被檢測(cè)的致病相關(guān)基因及其引物見表2，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。RT-qPCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)處理同1.3.1。

2 結(jié)果

2.1 VdHP1克隆

分別以大麗輪枝菌野生型菌株V592的基因組DNA和cDNA為模板，通過克隆測(cè)序得到全長為862 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白的cDNA為807 bp，序列分析顯示，該基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，編碼268個(gè)氨基酸。的預(yù)測(cè)編碼蛋白與大麗輪枝菌VdLs.17同源基因編碼的氨基酸序列相似性為98.95%，與非苜蓿輪枝菌（）的D7B24_004502基因編碼的氨基酸序列相似性為94.90%，與苜蓿輪枝菌（.）的VDBG_05451基因編碼的氨基酸序列相似性為94.48%，而與其他真菌沒有任何氨基酸序列相似性；在GenBank中進(jìn)行檢索，與已注釋的基因沒有任何序列相似性。上述結(jié)果表明是輪枝菌屬所特有的基因。

表2 被檢測(cè)的致病相關(guān)基因及其引物

2.2 VdHP1在大麗輪枝菌中的表達(dá)分析

通過RT-qPCR測(cè)定受棉花根系誘導(dǎo)后的表達(dá)特征，結(jié)果顯示V592菌株受棉花根系誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后的表達(dá)水平呈現(xiàn)劇烈上調(diào)，10 h達(dá)到最大值，12 h后轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著下降（圖1-A），表明可能在大麗輪枝菌侵染早期發(fā)揮作用。

對(duì)在大麗輪枝菌不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分生孢子中的表達(dá)量最高，分別是菌絲和微菌核中的14倍和28倍（圖1-B），表明在大麗輪枝菌中的表達(dá)具有組織差異性。

2.3 VdHP1基因敲除突變體和互補(bǔ)菌株的篩選

以野生型菌株V592為對(duì)照，將PCR初步篩選獲得的2個(gè)敲除突變體和互補(bǔ)菌株用2對(duì)特異引物進(jìn)行再次確認(rèn)，結(jié)果如圖2-B所示，用的特異引物只能從2個(gè)敲除突變體（和）中擴(kuò)增出457 bp的基因片段，用的特異引物只能從V592菌株和2個(gè)互補(bǔ)菌株（和）中擴(kuò)增出862 bp全長。上述結(jié)果表明在基因組水平上，敲除突變體中已被成功取代，互補(bǔ)菌株中得到回補(bǔ)。再對(duì)敲除突變體和互補(bǔ)菌株中的的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2-C所示，在2個(gè)敲除突變體和中幾乎不表達(dá)，而在互補(bǔ)菌株和中的表達(dá)恢復(fù)至野生型菌株水平，因此從轉(zhuǎn)錄水平再次表明，在和中被成功敲除，在互補(bǔ)菌株和中得到互補(bǔ)。

A：V592菌株被棉花根系誘導(dǎo)后VdHP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)VdHP1 transcriptional expression in V592 strain induced by cotton roots；B：VdHP1在V592菌株不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)VdHP1 transcriptional expression in different tissues of V592 strain

A：VdHP1基因敲除載體構(gòu)建圖Strategy diagram of VdHP1 knockout vector construction；B：利用特異引物對(duì)目標(biāo)基因VdHP1進(jìn)行PCR檢測(cè)Specific primers were used to detect VdHP1 by PCR；C：利用RT-qPCR對(duì)VdHP1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行確定Confirmation of transcriptional expression of VdHP1 by RT-qPCR analysis

2.4 VdHP1基因敲除突變體表型特征的觀察

在PDA培養(yǎng)基上，基因敲除突變體與V592菌株和互補(bǔ)菌株一樣形成典型的菌核型菌落，菌落生長速度也無明顯差異（圖3-A），說明基因敲除不影響大麗輪枝菌的菌落生長。將等量分生孢子接種在營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)微菌核的形成，接種14 d后，2個(gè)基因敲除突變體的微菌核干重和濕重與V592菌株和2個(gè)互補(bǔ)菌株相比也無明顯差異（圖3-B），表明不參與大麗輪枝菌微菌核的形成。

2.5 VdHP1基因敲除突變體產(chǎn)孢量的測(cè)定

與V592菌株相比，2個(gè)敲除突變體和的產(chǎn)孢量明顯減少（圖4），在接種第7 天時(shí)，和的產(chǎn)孢量分別是V592產(chǎn)孢量的46.62%和45.00%；而2個(gè)互補(bǔ)菌株和的產(chǎn)孢量恢復(fù)至野生型菌株的水平，表明參與大麗輪枝菌分生孢子的產(chǎn)生。

2.6 VdHP1基因敲除突變體菌絲形態(tài)觀察

顯微觀察結(jié)果顯示，與野生型菌株V592相比，2個(gè)基因敲除突變體分支菌絲呈現(xiàn)螺旋狀，產(chǎn)孢梗減少；而互補(bǔ)菌株和的菌絲體形態(tài)和分生孢子梗恢復(fù)至野生型水平（圖5）。表明與大麗輪枝菌菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢梗的形成有關(guān)，突變體產(chǎn)孢量的減少可能與產(chǎn)孢梗減少有關(guān)。

圖5 顯微鏡下菌絲的形態(tài)特征

2.7 VdHP1基因敲除突變體致病力測(cè)定

為了明確對(duì)大麗輪枝菌致病力的影響，以野生型菌株V592為對(duì)照，測(cè)定了基因敲除體對(duì)棉花的致病力。結(jié)果如圖6所示，接種10 d時(shí)所有植株開始出現(xiàn)萎蔫癥狀，隨著病情發(fā)展，基因敲除突變體導(dǎo)致的病害癥狀與對(duì)照相比明顯減輕。接種28 d時(shí)，V592菌株引起感病植株葉片萎蔫、焦枯及脫落，病情指數(shù)達(dá)到95.4，而敲除突變體和所致病害的病情指數(shù)則分別為44.3和43.2；互補(bǔ)菌株和對(duì)棉花的致病力明顯得到恢復(fù)，病情指數(shù)分別為92.2和91.1（圖6-A、6-B）。接種30 d時(shí)，對(duì)感病植株進(jìn)行剖桿觀察，V592菌株及2個(gè)互補(bǔ)菌株均導(dǎo)致棉桿維管束明顯變褐，而接種2個(gè)敲除突變體的棉花，其維管束基本不變色（圖6-C）。表明基因敲除影響大麗輪枝菌對(duì)棉花的致病力。

為了明確是否影響大麗輪枝菌在寄主體內(nèi)的定殖能力，通過qPCR對(duì)棉花中的真菌生物量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖6-D顯示，基因敲除突變體在根組織中的生物量顯著高于V592菌株和2個(gè)互補(bǔ)菌株，而在莖組織中的生物量又顯著低于V592和互補(bǔ)菌株，表明基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌在棉花莖中的擴(kuò)展受阻。

為了進(jìn)一步明確致病力下降是否與菌株的穿透能力下降有關(guān)，以V592為對(duì)照，對(duì)基因敲除突變體和互補(bǔ)菌株進(jìn)行了玻璃紙穿透試驗(yàn)，結(jié)果如圖6-F所示，V592菌株和2個(gè)互補(bǔ)菌株均可在接種第3天時(shí)穿透玻璃紙?jiān)贛M培養(yǎng)基上生長，而基因敲除突變體則在接種第5天時(shí)才能穿透玻璃紙。RT-qPCR結(jié)果顯示，與野生型V592菌株和互補(bǔ)菌株相比，在基因敲除突變體中，與大麗輪枝菌侵染釘形成相關(guān)的2個(gè)基因和以及與分泌結(jié)構(gòu)菌絲頸環(huán)形成相關(guān)基因的表達(dá)量均明顯下降（圖6-E）。表明基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌穿透延遲并且影響侵染釘及菌絲頸環(huán)形成相關(guān)基因的表達(dá)。

A：感病棉花的癥狀，照片拍攝于接種后20 d The symptoms of diseased cotton plants, the photograph were taken at 20?days post inoculation；B：棉花發(fā)病后的病情指數(shù)Disease index of cotton plants；C：感病棉花維管束變褐現(xiàn)象Vascular discoloration of diseased cotton plants；D：棉花根、莖、葉中的真菌生物量Relative quantification of fungal biomass in roots, stems and leaves of cotton plants；E：與侵染釘形成和分泌蛋白釋放相關(guān)基因在VdHP1基因敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量The transcriptional expression of genes involved in penetration peg formation and delivery of secretory protein in VdHP1 gene knockout mutants；F：玻璃紙穿透試驗(yàn)Cellophane penetration test of VdHP1 gene knockout mutants

2.8 致病相關(guān)基因在VdHP1基因敲除突變體中的表達(dá)

為了明確表達(dá)對(duì)其他致病相關(guān)基因的影響，首先構(gòu)建了基因過表達(dá)載體，獲得過表達(dá)菌株（和），RT-qPCR測(cè)定結(jié)果顯示，在過表達(dá)菌株中的表達(dá)量顯著高于野生型菌株V592中的表達(dá)量（圖7-A）。與野生型菌株V592相比，與黑色素合成相關(guān)的基因、、和在基因敲除體中的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，在過表達(dá)菌株中除外均顯著下調(diào)（圖7-B）；與之相反，與侵染釘形成有關(guān)的基因、、和分泌蛋白釋放有關(guān)的基因在基因敲除體中的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)，在過表達(dá)菌株中和表達(dá)量顯著上調(diào)（圖7-C）；同樣，與分生孢子產(chǎn)生有關(guān)的基因、、、、、和在基因敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，、、、、表達(dá)量在過表達(dá)菌株中顯著上調(diào)，和的表達(dá)則不受表達(dá)量影響（圖7-D）。上述結(jié)果表明，對(duì)與侵染釘形成、分泌蛋白釋放及分生孢子產(chǎn)生有關(guān)基因的表達(dá)具有正調(diào)控作用，對(duì)黑色素合成有關(guān)基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

A：VdHP1過表達(dá)菌株中的轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證Transcriptional expression of VdHP1 in V592 strain and overexpressed strains；B：大麗輪枝菌中黑色素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Transcriptional expression of genes involved in melanin synthesis；C：大麗輪枝菌中與穿透及分泌蛋白釋放相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Transcriptional expression of genes involved in penetration peg and delivery of secretory protein；D：大麗輪枝菌中產(chǎn)孢相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Transcriptional expression of genes involved in conidial production

3 討論

本研究從大麗輪枝菌中克隆到的與GenBank中已有功能注釋的基因沒有任何序列相似性，并且只與輪枝菌屬中的同源基因具有很高的序列相似性，表明該基因是輪枝菌屬特有的基因。Klosterman等通過亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽預(yù)測(cè)輪枝菌屬中大麗輪枝菌（VdLs.17菌株）和黑白輪枝菌（）（VaMs.102菌株）分別編碼780個(gè)和759個(gè)分泌蛋白，其中574個(gè)基因在2個(gè)種間保守[26]。由于許多真菌典型的效應(yīng)子蛋白是氨基酸數(shù)目＜400，半胱氨酸數(shù)＞4的小蛋白[27-29]，據(jù)此輪枝菌屬中246個(gè)未被注釋的基因編碼的蛋白為這類典型的效應(yīng)子蛋白[26]。而本研究克隆到的，通過亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽預(yù)測(cè)編碼的蛋白也是分泌蛋白，包含268個(gè)氨基酸，但是其半胱氨酸只有2個(gè)，因此VdHP1蛋白可能是輪枝菌屬中一種非典型效應(yīng)子蛋白。

在分生孢子中的表達(dá)量是微菌核中的28倍、菌絲的14倍，當(dāng)從大麗輪枝菌中敲除，因其不能在分生孢子和菌絲中表達(dá)，導(dǎo)致敲除突變體產(chǎn)孢梗和產(chǎn)孢量明顯減少，菌絲形態(tài)也發(fā)生改變，表明參與大麗輪枝菌的產(chǎn)孢過程。已有研究表明，大麗輪枝菌的產(chǎn)孢過程是多基因參與的過程，如[11]、[12]、[19]、[20]、[30]、[16]、[31]、[32]、[6]和[6]等基因敲除均導(dǎo)致大麗輪枝菌產(chǎn)孢量下降。本研究發(fā)現(xiàn)，正調(diào)控其中一些與產(chǎn)孢相關(guān)基因、、、、、、的表達(dá)，其中，[11]、[12]和[32]是參與調(diào)控產(chǎn)孢過程的轉(zhuǎn)錄因子，是G蛋白信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因[20]?；蚯贸龑?dǎo)致產(chǎn)孢量下降可能與這些產(chǎn)孢相關(guān)基因表達(dá)量下降有關(guān)，同時(shí)也表明可能通過與其他基因或信號(hào)途徑互作參與分生孢子的形成過程。

敲除突變體在棉花根、莖中的生物量測(cè)定結(jié)果表明，基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌在棉花莖中的擴(kuò)展受阻；與之一致的結(jié)果是，基因敲除體穿透玻璃紙的能力下降，并且與附著枝侵染釘形成相關(guān)的基因、、在基因敲除體中的表達(dá)量顯著下調(diào)[8]，表明基因敲除導(dǎo)致附著枝形成侵染釘?shù)哪芰ο陆?，從而?dǎo)致大麗輪枝菌穿透寄主細(xì)胞壁和在寄主體內(nèi)的擴(kuò)展能力下降。大麗輪枝菌發(fā)揮致病作用的途徑之一就是通過分泌各類效應(yīng)子蛋白與寄主互作，干擾或阻止植物免疫。是大麗輪枝菌侵染釘與寄主界面形成菌絲頸環(huán)結(jié)構(gòu)所必需的基因，其作用是釋放分泌蛋白[9]；在基因敲除體中的表達(dá)量顯著下調(diào)，表明基因敲除突變體致病力下降可能與其分泌效應(yīng)子能力下降有關(guān)。此外，[11]、[12]、[20]、[30]、[32]、[6]、[6]不僅是產(chǎn)孢相關(guān)基因，也是致病相關(guān)基因，它們?cè)诨蚯贸蛔凅w中的表達(dá)量顯著下調(diào)也可能是導(dǎo)致致病力下降的因素之一。

雖然有些致病相關(guān)基因的功能鑒定表明，其產(chǎn)孢過程與其微菌核形成過程相互偶聯(lián)，如[11]、[20]和[32]均與分生孢子產(chǎn)生和微菌核的形成有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不參與大麗輪枝菌微菌核形成，表明參與的產(chǎn)孢和致病過程不與微菌核形成途徑偶聯(lián)。已有研究表明，黑色素含量與大麗輪枝菌的致病力密切相關(guān)，[13]、[15]、[25]、[33]基因敲除均導(dǎo)致大麗輪枝菌致病力顯著下降，其中，和是真菌DHN黑色素合成途徑起始和結(jié)束的2個(gè)關(guān)鍵基因[13]；VdCmr1蛋白是調(diào)控黑色素合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子[13]；編碼的跨膜蛋白通過MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑調(diào)控大麗輪枝菌黑色素的合成和穿透寄主的能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)黑色素合成相關(guān)基因、、、的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，但是與這4個(gè)基因所涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是如何相互作用的還有待深入研究。

4 結(jié)論

從大麗輪枝菌中克隆到的是輪枝菌屬特有的新基因。基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌產(chǎn)孢量和產(chǎn)孢梗減少、菌絲形態(tài)發(fā)生改變、對(duì)寄主的致病力下降，表明與大麗輪枝菌分生孢子和產(chǎn)孢梗的產(chǎn)生有關(guān)，參與大麗輪枝菌致病。其他致病相關(guān)基因在敲除突變體中的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表明，對(duì)與侵染釘形成、分泌蛋白釋放及分生孢子產(chǎn)生相關(guān)基因的表達(dá)具有正調(diào)控作用，對(duì)黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

[1] 朱荷琴, 李志芳, 馮自力, 馮鴻杰, 魏鋒, 趙麗紅, 師勇強(qiáng), 劉世超, 周京龍. 我國棉花黃萎病研究十年回顧及展望. 棉花學(xué)報(bào), 2017, 29(增刊): 37-50.

ZHU H Q, LI Z F, FENG Z L, FENG H J, WEI F, ZHAO L H, SHI Y Q, LIU S C, ZHOU J L. Overview of cotton verticillium wilt research over the past decade in china and its prospect in future., 2017, 29(Suppl.): 37-50. (in Chinese)

[2] KAWCHUK L M, HACHEY J, LYNCH D R, KULCSAR F,van Rooijen G, Waterer D R, Robertson A, Kokko E, Byers R, Howard R G, FISHER R, PRUFER D. Tomatodisease resistance genes encode cell surface-like receptors., 2001, 98(11): 6511-6515.

[3] GAO F, ZHANG B S, ZHAO J H, HUANG J F, JIA P S, WANG S, ZHANG J, ZHOU J M, GUO H S. Deacetylation of chitin oligomers increases virulence in soil-borne fungal pathogens., 2019, 5(11): 1167-1176.

[4] QIN J, WANG K, SUN L, XING H, WANG S, LI L, CHEN S, GUO H S, ZHANG J. The plant-specific transcription factors CBP60g and SARD1 are targeted by asecretory protein VdSCP41 to modulate immunity., 2018, 7: DOI: 10.7554/eLife.34902.

[5] ZHOU B J, JIA P S, GAO F, GUO H S. Molecular characterization and functional analysis of a necrosis- and ethylene-inducing, protein-encoding gene family from., 2012, 25(7): 964-975.

[6] SANTHANAM P, VAN ESSE H P, ALBERT I, FAINO L, NURNBERGER T, THOMMA B P. Evidence for functional diversification within a fungal NEP1-like protein family., 2013, 26(3): 278-286.

[7] GUI Y J, ZHANG W Q, ZHANG D D, ZHOU L, SHORT D P G, WANG J, MA X F, LI T G, KONG Z Q, WANG B L, WANG D, LI N Y, SUBBARAO K V, CHEN J Y, DAI X F. Aextracellular cutinase modulates plant immune responses., 2018, 31(2): 260-273.

[8] ZHAO Y L, ZHOU T T, GUO H S. Hyphopodium-specific VdNoxB/VdPls1-dependent ROS-Ca2+signaling is required for plant infection by., 2016, 12(7): e1005793.

[9] ZHOU T T, ZHAO Y L, GUO H S. Secretory proteins are delivered to the septin-organized penetration interface during root infection by., 2017, 13(3): e1006275.

[10] BUI T T, HARTING R, BRAUS-STROMEYER S A, TRAN V T, LEONARD M, HOFER A, ABELMANN A, BAKTI F, VALERIUS O, SCHLUTER R, STANLEY C E, AMBROSIO A, BRAUS G H.transcription factors Som1 and Vta3 control microsclerotia formation and sequential steps of plant root penetration and colonisation to induce disease., 2019, 221(4): 2138-2159.

[11] LUO X, MAO H, WEI Y, CAI J, XIE C, SUI A, YANG X, DONG J. The fungal-specific transcription factorinfluences conidia production, melanized microsclerotia formation and pathogenicity in., 2016, 17(9): 1364-1381.

[12] SANTHANAM P, THOMMA B P H J.Sge1 differentially regulates expression of candidate effector genes., 2013, 26(2): 249-256.

[13] WANG Y, HU X, FANG Y, ANCHIETA A, GOLDMAN P H, HERNANDEZ G, KLOSTERMAN S J. Transcription factor VdCmr1 is required for pigment production, protection from UV irradiation, and regulates expression of melanin biosynthetic genes in., 2018, 164(4): 685-696.

[14] WANG Y, DENG C, TIAN L, XIONG D, TIAN C, KLOSTERMAN S J. The transcription factor VdHapX controls iron homeostasis and is crucial for virulence in the vascular pathogen., 2018, 3(5): e00400-18.

[15] LI J J, ZHOU L, YIN C M, ZHANG D D, KLOSTERMAN S J, WANG B L, SONG J, WANG D, HU X P, SUBBARAO K V, CHEN J Y, DAI X F. TheSho1-MAPK pathway regulates melanin biosynthesis and is required for cotton infection., 2019, 21(12): 4852-4874.

[16] RAUYAREE P, OSPINA-GIRALDO M D, KANG S, BHAT R G, SUBBARAO K V, GRANT S J, DOBINSON K F. Mutations in, a mitogen-activated protein kinase gene, affect microsclerotia formation and pathogenicity in., 2005, 48(2): 109-116.

[17] TIAN L, XU J, ZHOU L, GUO W. VdMsb regulates virulence and microsclerotia production in the fungal plant pathogen., 2014, 550(2): 238-244.

[18] TIAN L, YU J, WANG Y, TIAN C. The C2H2transcription factor VdMsn2 controls hyphal growth, microsclerotia formation, and virulence of., 2017, 121(12): 1001-1010.

[19] TZIMA A, PAPLOMATAS E J, RAUYAREE P, KANG S. Roles of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase A in virulence and development of the soilborne plant pathogen., 2010, 47(5): 406-415.

[20] TZIMA A K, PAPLOMATAS E J, TSITSIGIANNIS D I, KANG S. The G proteinsubunit controls virulence and multiple growth- and development-related traits in., 2012, 49(4): 271-283.

[21] 宋雯, 王春巧, 俞燕, 高峰, 黃家風(fēng). 棉花黃萎病菌鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白基因的功能分析. 棉花學(xué)報(bào), 2019, 31(2): 101-113.

SONG W, WANG C Q, YU Y, GAO F, HUANG J F. Functional analysis of an ornithine decarboxylase antizyme geneinisolated from cotton., 2019, 31(2): 101-113. (in Chinese)

[22] 王春巧, 陳志榮, 宋雯, 何芳, 黃家風(fēng). 一個(gè)編碼富含絲氨酸蛋白的基因影響大麗輪枝菌的微菌核形成、產(chǎn)孢及致病力. 植物病理學(xué)報(bào), 2019, 49(5): 650-659.

WANG C Q, CHEN Z R, SONG W, HE F, HUANG J F. A serine-rich protein identified inaffects microsclerotial formation, conidiation and pathogenicity., 2019, 49(5): 650-659. (in Chinese)

[23] WANG S, XING H, HUA C, GUO H S, ZHANG J. An improved single-step cloning strategy simplifies the-mediated transformation (ATMT)-based gene-disruption method for., 2016, 106(6): 645-652.

[24] GAO F, ZHOU B J, LI G Y, JIA P S, LI H, ZHAO Y L, ZHAO P, XIA G X, GUO H S. A glutamic acid-rich protein identified infrom an insertional mutagenesis affects microsclerotial formation and pathogenicity., 2010, 5(12): e15319.

[25] ZHANG T, ZHANG B, HUA C, MENG P, WANG S, CHEN Z, DU Y, GAO F, HUANG J.is required for melanin formation and virulence in a cotton wilt pathogen., 2017, 60(8): 868-879.

[26] KLOSTERMAN S J, SUBBARAO K V, KANG S, VERONESE P, GOLD S E, THOMMA B P, CHEN Z, HENRISSAT B, LEE Y H, PARK J,. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens., 2011, 7(7): e1002137.

[27] BOLTON M D, VAN ESSE H P, VOSSEN J H, DE JONGE R, STERGIOPOULOS I, STULEMEIJER I J, VAN DEN BERG G C, BORRAS-HIDALGO O, DEKKER H L, DE KOSTER C G, DE WIT P J, JOOSTEN M H, THOMMA B P. The novellysin motif effector Ecp6 is a virulence factor with orthologues in other fungal species., 2008, 69(1): 119-136.

[28] VAN ESSE H P, VAN’T KLOOSTER J W, BOLTON M D, YADETA K A, VAN BAARLEN P, BOEREN S, VERVOORT J, DE WIT P J, THOMMA B P. Thevirulence protein Avr2 inhibits host proteases required for basal defense., 2008, 20(7): 1948-1963.

[29] VAN ESSE H P, BOLTON M D, STERGIOPOULOS I, DE WIT P J, THOMMA B P. The chitin-bindingeffector protein Avr4 is a virulence factor., 2007, 20(9): 1092-1101.

[30] QI X, LI X, GUO H, GUO N, CHENG H. VdPLP, a patatin-like phospholipase in, is involved in cell wall integrity and required for pathogenicity., 2018, 9(3): 162.

[31] WANG Y, TIAN L, XIONG D, KLOSTERMAN S J, XIAO S, TIAN C. The mitogen-activated protein kinase gene,, regulates osmotic stress response, microsclerotia formation and virulence in., 2016, 88: 13-23.

[32] LI Z F, LIU Y J, FENG Z L, FENG H J, KLOSTERMAN S J, ZHOU F F, ZHAO L H, SHI Y Q, ZHU H Q., encoding CYC8 glucose repression mediator protein, is required for microsclerotia formation and full virulence in., 2015, 10(12): e0144020.

[33] 曹亞松, 王春生, 李海源, 徐小鴻, 商文靜, 楊家榮, 胡小平. 大麗輪枝菌基因克隆與功能分析. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 27(2): 275-282.

CAO Y S, WANG C S, LI H Y, XU X H, SHANG W J, YANG J R, HU X P. Cloning and functional analysis ofin., 2018, 27(2): 275-282. (in Chinese)

Cloning and Functional Analysis offrom cotton

SUN Qi, HE Fang, SHAO ShengNan, LIU Zheng, HUANG JiaFeng

(College of Agriculture/Key Laboratory of Oasis Agricultural Pest Management and Plant Protection Resources Utilization, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang)

【】The objective of this study is to determine the function of a novel gene () incausing cotton verticillium wilt, and to provide a basis for analyzing the pathogenic mechanism ofand the prevention and treatment of cottonverticillium wilt.【】The full length ofwas cloned and sequenced fromwild-type strain V592 genomic DNA and cDNA. The relative expression ofmeasured by reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR).gene knockout vector, complementary vector and overexpressed vector were constructed to producegene knockout strains, complementary strains and overexpressed strains by-mediated transformation, respectively. Taking wild-type strain V592 as the control, colony growth on PDA and hypha morphology were observed, microsclerotia production, conidial production and pathogenicity to cotton ofgene knockout mutants and complementary strains were measured. The relative expression of other genes involved in pathogenicity inknockout mutants and overexpressed strains was measured by RT-qPCR.【】The full length ofwas determined to be 862 bp and deduced protein contained 268 amino acids, which shared no significant sequence similarity to any known annotated gene in GenBank. The transcriptional expression ofwas significantly up-regulated when V592 strain induced by cotton roots for 6-12 h, indicating thatplays a role at the early stage of the infection. The transcriptional expression ofis differentially expressed in different tissues ofCompared with wild-type strain V592,gene knockout mutants showed significantly decreased conidia and conidiophores, branching hyphae were spirally shaped, and the pathogenicity to cotton was significantly decreased.The relative expression of genes involved in penetration peg formation (,,), delivery of secretory protein () and conidial production (,,,,,,) was significantly down-regulated inknockout mutants, but was up-regulated in the overexpressed strains; whereas, the relative expression of genes involved in melanin synthesis (,,,) was significantly up-regulated inknockout mutants, and was down-regulated in the overexpressed strains. 【】is participated in the production of conidia and conidiophores, and is involved in pathogenicity in.positively regulates the transcriptional expression of genes involved in penetration peg formation, delivery of secretory protein and conidial production, and negatively regulates the transcriptional expression of genes involved in melanin synthesis.

cottonverticillium wilt;;; conidiation; pathogenicity; transcriptional expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.14.011

2020-01-10；

2020-02-21

國家自然科學(xué)基金（31760497，31560494）

孫琦，E-mail：784594752@qq.com。通信作者劉政，E-mail：lzh8200@126.com。通信作者黃家風(fēng)，E-mail：jiafeng_huang@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）