李彩琳 吳定宇 呂鴻 張鴻翰 王彥權(quán) Najib Mohammerd 彭芳

摘 要 目的：研究美洲大蠊提取物脫脂膏及CⅡ-3（分別簡稱“脫脂膏”“CⅡ-3”）逆轉(zhuǎn)耐阿霉素（ADM）人肝癌細胞HepG2/ADM多藥耐藥的作用機制。方法：采用MTT法考察不同質(zhì)量濃度索拉非尼（陽性對照）、脫脂膏和CⅡ-3對HepG2/ADM細胞的毒性作用，并計算20%抑制濃度（IC20）。試驗設(shè)置敏感組、耐藥組、索拉非尼組、脫脂膏組和CⅡ-3組，敏感組使用HepG2細胞，后4組均使用HepG2/ADM細胞。敏感組和耐藥組細胞給予常規(guī)培養(yǎng)基，其余3組細胞給予相應(yīng)藥物（濃度均為IC20）。采用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)測定細胞中ADM含量;采用Western blotting法測定細胞中凋亡相關(guān)蛋白[B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、剪切型胱天蛋白酶9 p37 （Cleaved-Caspase-9 p37）]的表達水平;分別采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(yīng)法和免疫細胞化學(xué)染色法檢測細胞中多藥耐藥相關(guān)基因mRNA及蛋白[P-糖蛋白（P-gp）（MDR1基因表達產(chǎn)物）、肺耐藥蛋白（LRP）、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（BCRP）]和酶介導(dǎo)多藥耐藥途徑中相關(guān)基因mRNA及蛋白[谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST-π）、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（Topo Ⅱ）]的表達水平。結(jié)果：索拉非尼、脫脂膏、CⅡ-3對HepG2/ADM細胞的IC20分別為（2.40±0.16）、（200.44±27.52）、（18.00±1.82） μg/mL。與敏感組比較，耐藥組細胞中Bcl-2、P-gp、LRP、BCRP、Topo Ⅱ蛋白表達水平以及MDR1、LRP、BCRP、GST-π mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與耐藥組比較，脫脂膏組和? CⅡ-3組細胞中ADM含量顯著增加（P<0.05或P<0.01），MDR1 mRNA表達水平和LRP、BCRP、GST-π mRNA及其蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;CⅡ-3組細胞中Bcl-2蛋白表達水平、Topo Ⅱ mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01），Cleaved-Caspase-9 p37蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：脫脂膏、CⅡ-3可通過減少藥物外排、促進細胞凋亡、減少多藥耐藥相關(guān)基因和酶介導(dǎo)多藥耐藥途徑中相關(guān)基因的mRNA及其蛋白的表達等方式，逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細胞的多藥耐藥性，且CⅡ-3的效果優(yōu)于脫脂膏。

關(guān)鍵詞 美洲大蠊;脫脂膏;CⅡ-3;肝癌;多藥耐藥;HepG2/ADM細胞;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mechanism of Periplaneta americana extract degreasing cream and CⅡ-3 （shorted for “degreasing cream” and “CⅡ-3”） reversing the multi-drug resistance of human HepG2/ADM cells. METHODS： MTT assay was used to investigate the toxicity effects of different concentrations of sorafenib （positive control）， degreasing cream and CⅡ-3 on HepG2/ADM cells， then IC20 was calculated. The experiment was divided into sensitivity drug， drug-resistance group， sorafenib group， degreasing cream group and CⅡ-3 group. HepG2 cells were included in sensitivity group， and HepG2/ADM cells were included in the latter 4 groups. Sensitivity group and drug-resistance group were treated with routine medium， and other 3 groups were treated with relevant medicine （IC20 as drug concentration）. The content of ADM in HepG2/ADM cells was determined by Laser scanning confocal microscopy. The expression of apoptosis-related protein as Bcl-2 and Cleaved-Caspase-9 p37 were detected by Western blotting assay. RT-qPCR and immunocytochemistry were adopted to detect mRNA and protein expressions that related to multidrug resistance [P-gp （expression produce of MDR1 gene）， LRP， BCRP] and that related to enzyme-mediated multidrug resistance pathway （GST-π and Topo Ⅱ）. RESULTS： The IC20 of degreasing cream， CⅡ-3 and sorafenib were （2.40±0.16）， （200.44±27.52）， （18.00±1.82） μg/mL， respectively. Compared with sensitivity group， the protein expressions of Bcl-2， P-gp， LRP， BCRP and Topo Ⅱ， the mRNA expressions of MDR1， LRP， BCRP and GST-π were increased significantly in drug resistance group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with drug-resistance group， the mRNA and protein expression of MDR1 mRNA and LRP，BCRP，GST-π were significantly decreased in degreasing cream group and CⅡ-3 group （P<0.05 or P<0.01）; the protein expression of Bcl-2 and the mRNA expression of Topo Ⅱ were significantly decreased （P<0.01）， while the protein expression level of Cleaved-Caspase-9 p37 was significantly increased in CⅡ-3 group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Degreasing cream and CⅡ-3 can reverse multidrug resistance of HepG2/ADM cells by reducing drug efflux，promoting cell apoptosis，reducing the mRNA and protein expression of multi-drug resistance gene as well as gene in enzyme-mediated multi-drug resistance pathway. The effect of CⅡ-3 is better than that of degreasing cream.

KEYWORDS? ?Periplaneta americana; Degreasing cream; CⅡ-3; Hepatocellular carcinoma; Multi-drug resistance; HepG2/ADM cells; Mechanism

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其病死率居全球癌癥中的第3位，具有“癌中之癌”之稱[1-2]。目前，臨床除化療外，常采用手術(shù)治療、放療、生物治療等多種方法聯(lián)合治療肝癌，但治療效果仍不顯著，這主要是由于腫瘤細胞容易對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥（MDR），使藥物療效降低[3]。藥物產(chǎn)生MDR的機制復(fù)雜，現(xiàn)已明確的主要包括影響凋亡相關(guān)蛋白、耐藥相關(guān)蛋白的表達以及產(chǎn)生MDR相關(guān)蛋白促進藥物外排等[4-5]。臨床上常通過使用P-糖蛋白（P-gp，基因MDR1的表達產(chǎn)物）抑制劑來減少化療藥物的MDR，但由于藥物的毒性、相互作用及作用機制單一等多種因素使其效果并不顯著。中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的獨特優(yōu)勢，具有較好的開發(fā)潛力[6]。

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）又稱“蟑螂”，具有極強的生命力，并具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、減輕肝損傷、抗腫瘤等多種藥理作用[7-8]。本課題組前期研究表明，美洲大蠊提取物脫脂膏（美洲大蠊干燥蟲體經(jīng)70%乙醇冷浸提取3次，合并、濃縮提取液后得浸膏，再將浸膏去除油脂后得到的褐色黏稠亮狀物稱為“脫脂膏”）和CⅡ-3（浸膏經(jīng)聚酰胺柱洗脫濃縮，冷凍干燥后得到的黃褐色凍干粉末稱為“CⅡ-3”）均具有抑制腫瘤生長、逆轉(zhuǎn)肝癌細胞MDR等作用[9-11]，但其作用機制尚未明確。因此，本研究擬采用人肝癌細胞株HepG2和耐阿霉素（ADM）人肝癌細胞株HepG2/ADM為試驗對象，以索拉非尼作為陽性對照，分別從細胞內(nèi)藥物累積和細胞凋亡、耐藥相關(guān)蛋白表達及酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)基因和蛋白表達等方面深入探討脫脂膏和CⅡ-3逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細胞MDR的機制，旨在為美洲大蠊相關(guān)產(chǎn)品進一步研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）;BB16UV/BB5060UV型垂直流超凈工作臺、BSC-? ? ?1000ⅡA2型二級生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;DSR-22型數(shù)控搖床振蕩器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）;SN255939型全自動酶標儀、3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;785BR15145型聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;BSA24S型電子分析天平（德國Sartorius公司）;TD3型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）;CKX31型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

脫脂膏（褐色黏稠膏狀，批號：P14805-20171023，得率：約75.18%）和CⅡ-3（黃褐色凍干粉末，批號：17102125，得率：約0.2%）均由云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室制備[12-13];ADM（含量：98.0%～102.0%）、BeyoRTTMⅡ cDNA第一鏈合成試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒、4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清（FBS，美國Gibco公司，批號：2166446）;青鏈霉素雙抗（批號：20190909）、索拉非尼原料藥（批號：28154，純度：≥99.0%）均購自北京索萊寶科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基（上海生工生物工程股份有限公司，批號：F909FA0001）;兔源B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）、P-gp、肺耐藥蛋白（LRP）、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（BCRP）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST-π）、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（Topo Ⅱ）多克隆抗體（美國Proteintech公司）;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（美國Abcam公司，批號：ab6721）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ迷噭疄殡p蒸水。PCR試驗中mRNA引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 細胞

人肝癌細胞株HepG2和人肝癌耐藥細胞株HepG2/ADM均由江蘇齊氏生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

分別將HepG2、HepG2/ADM細胞接種于含10%FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（下同）。其中，HepG2/ADM細胞的培養(yǎng)基中加入0.5 μg/L的ADM，以維持細胞的耐藥性。兩種細胞均每1～2天更換1次培養(yǎng)基，待細胞長滿培養(yǎng)瓶80%以上時進行傳代，采用對數(shù)生長期（第3～5代）的細胞進行試驗。

2.2 藥液的制備

將脫脂膏、CⅡ-3分別用生理鹽水制備成20 mg/mL（均按生藥量計，下同）的母液，以微孔濾膜濾過除菌后，于4 ℃保存，備用。試驗時再用生理鹽水稀釋到所需質(zhì)量濃度。

2.3 細胞毒性考察

采用MTT法測定索拉非尼、脫脂膏和CⅡ-3對HepG2/ADM細胞的毒性。取對數(shù)生長期的HepG2/ADM細胞，以0.25%胰酶消化后，用常規(guī)培養(yǎng)基重懸制成細胞密度為2×105個/mL的細胞懸液，按100 μL/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h。然后將細胞分為索拉非尼組（2、4、8、16、32 μg/mL）、脫脂膏組（80、160、320、640、1 280 μg/mL）、CⅡ-3組（10、20、40、80、160 μg/mL），每個質(zhì)量濃度均設(shè)置6個復(fù)孔。另設(shè)空白對照組（含細胞但不含藥物）和試劑對照組（不含細胞和藥物）。加藥培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入含10%MTT（100 μL/孔）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;再加入DMSO（100 μL/孔），振蕩30 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用全自動酶標儀在570 nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，計算細胞存活率[細胞存活率（%）=（給藥組OD值-試劑對照組OD值）/（空白對照組OD值-試劑對照組OD值）×100%]，并采用SPSS 17.0軟件計算藥物的20%抑制濃度（IC20）。

2.4 細胞分組與給藥

試驗共設(shè)置5個組，分別為敏感組、耐藥組、索拉非尼組（陽性對照）、脫脂膏組和CⅡ-3組。敏感組加入HepG2細胞，其余4組均加入HepG2/ADM細胞。給藥時，敏感組和耐藥組細胞加入常規(guī)培養(yǎng)基，其余3組分別加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基（終質(zhì)量濃度均為各自的IC20）。

2.5 美洲大蠊提取物對HepG2/ADM細胞中藥物累積的影響考察

采用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)進行測定。取對數(shù)生長期的兩種細胞，分別以0.25%胰酶消化后，用常規(guī)培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按8×106個/皿的細胞密度接種于放有爬片的小皿中（直徑3 cm），搖勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞培養(yǎng)完畢后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，然后按“2.4”項下方法進行分組、給藥，每組設(shè)置10個復(fù)孔。各組細胞培養(yǎng)48 h后，以PBS清洗，再加入含5? ? ? ?μg/mL ADM的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h;取出后用冷PBS清洗5 min×3次，加入4%多聚甲醛避光固定30 min;再用冷PBS清洗5 min×2次，加入DAPI核染5 min;然后用冷PBS清洗5 min×3次;最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，避光保存，次日于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。鏡下ADM陽性表達為紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。采用Image J 6.0軟件計算陽性細胞熒光強度值（熒光強度值越大表明藥物含量越高）。

2.6 美洲大蠊提取物對HepG2/ADM細胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響考察

采用Western blotting法測定細胞中Bcl-2、剪切型Caspase-9 p37（Cleaved-Caspase-9 p37）蛋白表達水平。取對數(shù)生長期的兩種細胞，分別以0.25%胰酶消化后，用常規(guī)培養(yǎng)基制成細胞密度為5×105個/mL的單細胞懸液，按7.5×105 個/孔的細胞密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項下方法分組、給藥，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。細胞培養(yǎng)完畢后，用PBS清洗3 min×2～3次，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入RIPA裂解液50 μL（含蛋白酶抑制劑、磷酸化抑制劑），冰上孵育30 min，用移液器反復(fù)吹打，確保細胞完全裂解;然后在4 ℃下以20 000 r/min離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。采用BCA法進行蛋白定量后，變性處理，再經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳分離，然后轉(zhuǎn)入醋酸纖維素印跡膜上;以5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入Bcl-2（1 ∶ 1 500）、Caspase-9/（1 ∶ 800）、GAPDH（1 ∶ 5 000）一抗，4 ℃下孵育過夜;以TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（1 ∶ 500），室溫下孵育2 h;以TBST洗膜6 min×3次，然后置于凝膠成像儀中，以電化學(xué)法（ECL）顯影。采用Image J 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參（GAPDH）蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 美洲大蠊提取物對HepG2/ADM細胞中MDR相關(guān)基因mRNA及其蛋白的影響考察

2.7.1 MDR相關(guān)基因mRNA表達 采用實時熒光定量-PCR法測定細胞中MDR1、LRP、BCRP的mRNA表達水平。取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，按2.4×105個/孔的細胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項下方法分組、給藥，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。細胞培養(yǎng)完畢后，用Trizol 試劑提取總RNA，驗證其濃度和純度，然后取總RNA 2 μg，按BeyoRTTM Ⅱ cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作合成cDNA，并以cDNA為模板采用兩步法進行PCR擴增。反應(yīng)體系（20 ?L）：Beyo FastTM SYBR Green qPCR Mix （2×）10 ?L，上、下游引物各2 ?L，Template 2 ?L、去核酸酶水4 ?L。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。引物序列：MDR1上游引物序列為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，擴增產(chǎn)物大小為226 bp;LRP 上游引物序列為5′-GCTCATAGGATATGGGACACACT-3′，下游引物序列為5′-CCAGGAAATCAGTTGGTGAGAAT-3′，擴增產(chǎn)物大小為121 bp;BCRP上游引物序列為5′-GTTCTCAGCAGCTCTT- CGGCTT-3′，下游引物序列為5′-TCCTCCAGACACA- CCACGGATA-3′，擴增產(chǎn)物大小為268 bp;GAPDH上游引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG- 3′，擴增產(chǎn)物大小為197 bp。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的mRNA表達水平（式中Ct表示熒光信號強度達到設(shè)定閾值時經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。

2.7.2 MDR相關(guān)蛋白表達 采用免疫細胞化學(xué)染色法檢測細胞中P-gp、LRP、BCRP蛋白表達水平。取對數(shù)生長期細胞，以0.25%胰酶消化后，按2.4×106個/孔的細胞密度接種于預(yù)置有爬片的12孔板中，待細胞貼壁生長良好后，按“2.4”項下方法分組、給藥，培養(yǎng)48 h。取出各組長有細胞的爬片，以PBS漂洗2 min×3次;以4%多聚甲醛固定30 min后，將3% H2O2-甲醇混合液（1 ∶ 4，V/V）滴在各組爬片上，室溫孵育30 min;以水洗5 min×2次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉10 min;加入P-gp（1 ∶ 500）、LRP（1 ∶ 400）、BCRP（1 ∶ 400）一抗，4 ℃下孵育過夜;以PBS清洗2 min×3次，滴加二抗（1 ∶ 1 000），37 ℃下孵育30 min;以PBS清洗2 min×3次，用DAB顯色試劑盒顯色（棕色）后加入水終止反應(yīng);用水清洗5 min×3次，加入蘇木素復(fù)染40 s;將標本放入飽和Na2HPO4溶液中浸泡2 min，取出后立即用水清洗5 min×3次;用乙醇梯度（50%、75%、85%、95%、100%）脫水，甘油封片。光鏡下觀察各組細胞中P-gp、LRP、BCRP蛋白表達情況，以細胞核有明顯棕色或棕黃色顆粒為陽性表達。采用Image J 6.0軟件計算陽性細胞的平均光密度值。

2.8 美洲大蠊提取物對HepG2/ADM細胞中酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)基因mRNA及其蛋白的影響考察

2.8.1 對酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)基因mRNA表達的影響 參照“2.7.1”項下方法測定細胞中TopoⅡ、GST-π mRNA表達水平。其中，GST-π上游引物序列為5′- AGTCTCCTCGGTTCCCAAGCAA-3′，下游引物序列為5′-GGTGCTGGTTAAAGAGTTCGCC-3′，擴增產(chǎn)物大小為132 bp;TopoⅡ上游引物序列為5′-TTAATGCTGCGGACAACAAACA-3′，下游引物序列為5′-CGACCACCTGTCACTTTCTTTT-3′，擴增產(chǎn)物大小為217 bp;其余試驗條件均與“2.7.1”項下相同。

2.8.2 對酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)蛋白表達的影響 參照“2.7.2”項下方法檢測細胞中Topo Ⅱ、GST-π蛋白表達水平。其中，一抗的稀釋比例均為1 ∶ 200;其余試驗條件均與“2.7.2”項下相同。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細胞毒性考察結(jié)果

3種藥物分別作用48 h后，均對HepG2/ADM細胞生長有抑制作用，且均呈一定的濃度依賴性趨勢。索拉非尼、脫脂膏、CⅡ-3的IC20分別為（2.40±0.16）、（200.44±27.52）、（18.00±1.82） μg/mL，三者間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各組細胞的存活率測定結(jié)果見圖1。

3.2 美洲大蠊提取物對細胞藥物累積的影響

給藥48 h后，與敏感組比較，耐藥組細胞中ADM含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與耐藥組比較，索拉非尼組、脫脂膏組、CⅡ-3組細胞中ADM含量均顯著增加（P<0.05）。3個給藥組間比較，細胞中ADM含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組細胞的共聚焦激光掃描顯微圖見圖2（其中，Merge圖為融合熒光疊加圖），細胞中ADM含量測定結(jié)果見表1。

3.3 美洲大蠊提取物對耐藥細胞HepG2/ADM中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與敏感組比較，耐藥組細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），Cleaved-Caspase-9 p37蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與耐藥組比較，CⅡ-3組細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），索拉非尼組、CⅡ-3組細胞中Cleaved-Caspase-9 p37蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與索拉非尼組比較，CⅡ-3組細胞中Bcl-2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組細胞中Bcl-2、Cleaved-Caspase-9 p37蛋白表達電泳圖見圖3，蛋白表達水平測定結(jié)果見表2。

3.4 美洲大蠊提取物對HepG2/ADM細胞中MDR相關(guān)基因mRNA及其蛋白表達的影響

3.4.1 MDR相關(guān)基因mRNA表達 與敏感組比較，耐藥組細胞中MDR1、LRP、BCRP mRNA表達水平均顯著升高（P<0.01）。與耐藥組比較，索拉非尼組細胞中LRP、BCRP mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01），但MDR1 mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）;脫脂膏組細胞中MDR1、BCRP mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），但LRP mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）;CⅡ-3組細胞中MDR1、LRP、BCRP mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01）。與索拉非尼組比較，脫脂膏組、CⅡ-3組細胞中MDR1 mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01），CⅡ-3組細胞中LRP mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組細胞中MDR1、LRP、BCRP mRNA表達水平測定結(jié)果見表3。

3.4.2 MDR相關(guān)蛋白表達 與敏感組比較，耐藥組細胞中P-gp、LRP、BCRP蛋白表達水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與耐藥組比較，各給藥組細胞中LRP、BCRP蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），但細胞中P-gp蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。與索拉非尼組比較，脫脂膏組、CⅡ-3組細胞中P-gp蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），CⅡ-3組細胞中LRP、BCRP蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組細胞中P-gp、LRP、BCRP蛋白表達的免疫細胞化學(xué)染色顯微圖見圖4，蛋白表達水平測定結(jié)果見表4。

3.5 美洲大蠊提取物對HepG2/ADM細胞中酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)基因mRNA及其蛋白表達的影響

3.5.1 酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)基因mRNA表達 與敏感組比較，耐藥組細胞中GST-π mRNA表達水平顯著升高（P<0.01），但Topo Ⅱ mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與耐藥組比較，索拉非尼組細胞中Topo Ⅱ mRNA表達水平和脫脂膏組、CⅡ-3組細胞中GST-π mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01）。與索拉非尼組比較，脫脂膏組、CⅡ-3組細胞中GST-π mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中GST-π、Topo Ⅱ mRNA表達水平測定結(jié)果見表5。

3.5.2 酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)蛋白表達 與敏感組比較，耐藥組細胞中TopoⅡ蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），但GST-π蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與耐藥組比較，索拉非尼組細胞中GST-π蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），但脫脂膏組、CⅡ-3組細胞中GST-π蛋白表達水平和索拉非尼組、CⅡ- 3組細胞中Topo Ⅱ蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。與索拉非尼組比較，脫脂膏組、CⅡ- 3組細胞中GST-π蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），CⅡ- 3組Topo Ⅱ蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組細胞中GST-π、Topo Ⅱ蛋白表達的免疫細胞化學(xué)染色顯微圖見圖5，蛋白表達水平測定結(jié)果見表6。

4 討論

本研究利用ADM自發(fā)熒光的特點，通過激光掃描共聚焦顯微技術(shù)觀察其在細胞中的累積情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)脫脂膏、CⅡ-3處理后，細胞中ADM含量明顯增加，即藥物的外排減少。常規(guī)情況下，耐藥細胞通過使藥物外排產(chǎn)生耐藥性，故細胞內(nèi)藥物含量應(yīng)減少，但由于本研究中采用耐ADM的細胞系，培養(yǎng)時為了維持細胞耐藥性，加入了含ADM的培養(yǎng)基培養(yǎng)，所以在本研究耐藥組細胞中ADM含量較敏感組反而增加。化學(xué)治療仍然為目前臨床上治療腫瘤的主要手段，索拉非尼為臨床常用且是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于治療晚期肝癌的分子抑制劑，故本研究以其作為陽性對照藥[14]。

細胞凋亡是多基因嚴格控制的細胞自主死亡過程，這些基因包括抑癌基因p53、Caspase家族、Bcl-2家族等。Bcl-2作為重要的抗凋亡因子，通過和特定的蛋白[如B細胞淋巴瘤xL（Bcl-xL）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等]形成二聚體后，作為在細胞死亡信號通路上的分子開關(guān)，調(diào)控細胞凋亡。Bcl-2表達增加時，可阻止細胞凋亡而產(chǎn)生耐藥性[15]。Caspase-9位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)上游，當?shù)蛲銎鹗夹盘栕饔糜诰€粒體后，引起線粒體釋放細胞色素C（Cyt-C）;Cyt-C與凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）結(jié)合并使Apaf-1構(gòu)象改變形成八聚體，后者與Caspase-9 p37結(jié)合并誘導(dǎo)其發(fā)生自我催化;活化的Cleaved-Caspase-9 p37亞基使級聯(lián)反應(yīng)進一步放大，從而促進細胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，CⅡ-3作用后，耐藥細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)，促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-9 p37表達顯著上調(diào)，表明CⅡ-3可促進細胞凋亡。

P-gp和BCRP均可與三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合，通過ATP供能，使細胞內(nèi)藥物泵出，減少細胞內(nèi)藥物含量，從而使細胞產(chǎn)生耐藥性[17-18]。LRP在MDR腫瘤細胞中過度表達，阻滯作用于細胞核的化療藥物進入細胞核，或?qū)⒓毎麅?nèi)藥物泵出核外，從而引起腫瘤MDR[19]。本研究結(jié)果顯示，脫脂膏、CⅡ-3作用后，耐藥細胞中MDR1 、BCRP mRNA表達以及LRP、BCRP蛋白表達均顯著下調(diào)，并且CⅡ-3作用后耐藥細胞中LRP mRNA表達也顯著下調(diào)。但本試驗中出現(xiàn)MDR1 mRNA表達下調(diào)而其對應(yīng)的表達產(chǎn)物P-gp蛋白表達卻上調(diào)的情況，具體原因有待進一步分析。

GST-π是一種多功能藥物代謝酶，其不僅具有解毒功能，而且可以通過催化谷胱甘肽與進入胞內(nèi)的化療藥物結(jié)合，快速降低藥物有效濃度，對降低化療藥物的耐藥性發(fā)揮了重要作用;TopoⅡ是體內(nèi)重要的核酸酶，其與有絲分裂、染色體配對、基因重組和轉(zhuǎn)錄及DNA損傷修復(fù)有密切關(guān)系，參與DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制分離等過程，其活性增強，可增強DNA修復(fù)能力，降低化療藥物的細胞毒性，從而產(chǎn)生耐藥性[20]。本研究結(jié)果顯示，脫脂膏、CⅡ-3作用后，耐藥細胞中GST-π mRNA及其蛋白的表達均顯著下調(diào)，并且CⅡ-3作用后耐藥細胞中Topo Ⅱ蛋白表達亦顯著下調(diào)。

綜上，脫脂膏、CⅡ-3可通過減少藥物外排、促進細胞凋亡、減少MDR和酶介導(dǎo)MDR途徑中相關(guān)基因的mRNA及其蛋白的表達等方式，逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細胞的MDR，且CⅡ-3的效果優(yōu)于脫脂膏。在后續(xù)研究中，本實驗室將對脫脂膏和CⅡ-3聯(lián)合化療藥物逆轉(zhuǎn)MDR進行進一步的體內(nèi)研究，為美洲大蠊提取物聯(lián)合化療藥物提高臨床肝癌治療效果提供實驗基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-02-27 修回日期：2020-06-28）

（編輯：林 靜）