鄭 穎，李小華，李香營(yíng)，陳漠水

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，?？谑腥嗣襻t(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570208)

高血壓繼發(fā)左心室肥厚和心肌纖維化誘發(fā)心衰，故逆轉(zhuǎn)左心室肥厚和心肌纖維化已成為高血壓治療的潛在策略之一[1]。小檗堿(BBR)又稱黃連素，其可有效地抑制左心室肥厚，以及抑制多種因素導(dǎo)致的心肌纖維化，改善心功能[2]。microRNAs(miRNAs)是一種短鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，miRNAs參與高血壓等慢性后負(fù)荷增加導(dǎo)致的以心肌肥厚和心肌纖維化為特點(diǎn)的心肌重構(gòu)[3]。最近有研究[4]提示小檗堿可能對(duì)miR-29b有調(diào)控作用，干預(yù)心肌纖維化。本研究擬通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄法建立壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚模型，探討小檗堿對(duì)大鼠高血壓左室肥厚形成過(guò)程中心肌纖維化的預(yù)防作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1)動(dòng)物：雄性健康SD大鼠40只，體重200 g左右，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。

2)主要儀器：微量核酸蛋白分光光度計(jì)Nanodrop ND-2000C(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)、T100 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)、CFX connect定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)。

3)主要藥物與試劑：鹽酸小檗堿(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：B139120)；羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Masson三色染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BA4079B)；相關(guān)分子生物學(xué)耗材均購(gòu)自Axygen公司，均為無(wú)RNase、DNase產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司(貨號(hào)：RR037A)，SuperReal PreMix Color(SYBR Green)購(gòu)自TIANGEN公司(貨號(hào)：FP215-02)，Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer Set(廣州Ribobio公司，貨號(hào)：miRQ0000801-1-2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模、分組與給藥

將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)10只與手術(shù)組30只。手術(shù)組采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備壓力負(fù)荷性大鼠模型：以10%水合氯醛[0.35 mL·(100 g)-1)]腹腔注射麻醉，麻醉后腹部脫毛、消毒，經(jīng)下腹部臍中線分層切開(kāi)腹腔，在雙腎動(dòng)脈上段0.5 cm處分離腹主動(dòng)脈，放置直徑為0.6 mm的小圓棒(縮窄后腹主動(dòng)脈外徑約0.6 mm)，緊貼腹主動(dòng)脈，平行放置，用4號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和小圓棒一起結(jié)扎，而后抽出小圓棒使腹主動(dòng)脈縮窄。假手術(shù)組只暴露分離腹主動(dòng)脈后關(guān)腹腔不做任何處理，術(shù)后連續(xù)3 d用10萬(wàn)U青霉素鈉肌內(nèi)注射預(yù)防感染。

將手術(shù)組造模成活大鼠24只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(Model組)12只和小檗堿組(BBR組)12只。BBR組將鹽酸小檗堿用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，術(shù)后1周予灌胃給藥，100 mg·kg-1·d-1；Sham組及Model組予等量生理鹽水灌胃。分別于術(shù)后8周進(jìn)行取材，心尖部分取材置于4%多聚甲醛固定做病理檢測(cè)，其余部分液氮閃凍后，-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 心臟肥大指數(shù)計(jì)算

處死大鼠前稱取大鼠體重，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，迅速開(kāi)胸取出完整心臟，用冰浴預(yù)冷生理鹽水洗凈殘血，濾紙吸干心臟并用天平(萬(wàn)分之一)稱取心臟重量，計(jì)算心臟肥大指數(shù)(HW/BW)。HW/BW=心臟重量(g)/體重(kg)。

1.2.3 Masson染色法檢測(cè)心肌間質(zhì)膠原沉積

心肌組織包埋切片后，厚度4 μm，切片脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染色5～10 min，流水稍洗、1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘、麗春紅酸性品紅染液染5～10 min，流水稍洗、磷鉬酸溶液處理約5 min，不用水洗直接加甲苯胺藍(lán)染液或亮綠復(fù)染5 min、1%冰醋酸處理1 min，95%酒精脫水多次、無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，中心樹(shù)膠封固。采用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0測(cè)量膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)(collagenvolume fraction，CVF)，即膠原纖維區(qū)所占觀察視野的百分比，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算其均值，作為心肌纖維化指標(biāo)。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)心肌組織miRNA-29b及其靶基因的表達(dá)

使用Generay公司高純總RNA快速提取試劑盒提取心肌組織總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer Set(廣州Ribobio公司)檢測(cè)大鼠miRNA-29b，Bulge-LoopTMmiRNA primer與miRNA 3′端結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶催化逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6 snRNA為內(nèi)參照使用FX connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀定量miRNA-29b的表達(dá)，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，采用相對(duì)定量2-△△Ct法進(jìn)行定量，各反應(yīng)重復(fù)3次，n=5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HW/BW值比較

Sham組、Model組、BBR組HW/BW值分別為(2.82±0.23)、(4.11±0.33)、(3.62±0.40)g·kg-1，Model組、BBR組較Sham組顯著增加(P<0.01)，BBR組較Model組顯著減少(P<0.05)。

2.2 小檗堿對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠左心室心肌膠原纖維化的影響

Masson染色顯示血管和心肌中的膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色(圖1)。Sham組、Model組、BBR組CVF值分別為(2.81±1.54)%、(14.95±2.16)%、(12.11±2.19)%，Model組、BBR組較Sham組顯著增加(P<0.01)，BBR組較Model組顯著減少(P<0.05)。

2.3 小檗堿對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠左心室心肌成熟miR-29b及其靶基因表達(dá)的影響

與Sham組比較，Model組、BBR組miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，miR-29b表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)。與Model組比較，BBR組miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，miR-29b表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討論

高血壓是常見(jiàn)的心血管疾病，約1/3以上高血壓患者會(huì)出現(xiàn)左心室肥厚和心肌纖維化。左心室肥厚與心臟舒縮功能的下降、冠脈儲(chǔ)量的減少等密切相關(guān)，是猝死和充血性心力衰竭的主要的危險(xiǎn)因素，同樣以心臟成纖維細(xì)胞(CFs)增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積為特征的心肌纖維化也已被證明在高血壓引起的心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[5-6]，故逆轉(zhuǎn)左心室肥厚和心肌纖維化已成為治療高血壓，預(yù)防心力衰竭的潛在策略和近年來(lái)高血壓防治領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

miRNAs是一種短鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。有研究[7-8]顯示miRNA可以調(diào)節(jié)心肌肥大、纖維化，對(duì)高血壓的發(fā)生、發(fā)展有重要影響，并可作為高血壓潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目前已明確其作用機(jī)制主要與TGF-β1/Smad信號(hào)通路[9]及腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)介導(dǎo)[10]等密切相關(guān)。miR-29b在胚胎組織中幾乎不表達(dá)，在成熟組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)。朱柯等[11]發(fā)現(xiàn)扶正化瘀方抗心肌纖維化的作用可能與其抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖，并促進(jìn)CFs的凋亡及miR-29b-5p表達(dá)有關(guān)。也有學(xué)者認(rèn)為MiR-29b通過(guò)激活Notch信號(hào)通路抑制心肌纖維化和心肌肥厚，保護(hù)心肌細(xì)胞發(fā)展為心肌梗死[12]。

有研究[2,13]發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)壓力誘導(dǎo)的心肌肥厚有顯著的治療作用，其作用機(jī)制和小檗堿通過(guò)上調(diào)心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-29b的表達(dá)，促進(jìn)缺血誘導(dǎo)的血管新生，改善心肌梗死小鼠的心功能有關(guān)[14]。本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄法致壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚模型證明小檗堿可以顯著抑制大鼠壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型心肌肥厚和心肌纖維化。大鼠壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型心肌組織miR-29b水平顯著降低，miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA水平明顯增加，而小檗堿治療后可以顯著上調(diào)其心肌組織miR-29b水平，降低miR-29b靶基因col1a1和col3a1 mRNA水平，提示小檗堿的抗心肌肥厚和心肌纖維化的機(jī)制可能與小檗堿對(duì)miR-29b水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。這和ZHU等[14]研究結(jié)果基本相似，其通過(guò)結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈在小鼠中建立心肌梗死模型，評(píng)估血管生成并測(cè)定miR-29b的表達(dá)，認(rèn)為小檗堿增加miR-29b表達(dá)并促進(jìn)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而改善心臟功能。故本研究為小檗堿治療心肌肥厚及纖維化提供了理論依據(jù)，為心肌肥厚與纖維化疾病的治療提供新的治療靶點(diǎn)、新思路。