韓 飛，朱 祥，張 敏，趙熾娜，李俊凱

(長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/湖北省農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心，湖北 荊州 434025)

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是VERMA等[1]1998年在印度西北部塔爾沙漠的灌木根際土壤中分離得到的一種能進(jìn)行純培養(yǎng)的類菌根真菌，其在生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、功能及血清學(xué)上與叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungus)中的Glomus和Gigaspora相似[2]，但寄主更加廣泛，還可以在多種合成和半合成培養(yǎng)基上進(jìn)行營養(yǎng)生長、繁殖[3]，P.indica不僅可以促進(jìn)植株生長和種子萌發(fā)、增加植物生物量及側(cè)根數(shù)[4-5]，還能提高植物對(duì)N、P、K的吸收[6-7]，增強(qiáng)植物抗逆性[8]，但其在土壤中對(duì)農(nóng)藥殘留的影響未曾有相關(guān)報(bào)道[9]。

乙草胺(Acetochlor)是美國孟山都公司開發(fā)的一種芽前選擇性除草劑，主要用于防除一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草。然而，其在用藥量過大或者施藥后遇低溫高濕天氣時(shí)，易對(duì)作物產(chǎn)生藥害[10]；同時(shí)還會(huì)對(duì)農(nóng)田土壤及地下水造成污染，嚴(yán)重影響了農(nóng)田土壤的生物區(qū)系結(jié)構(gòu)及酶活性[11-12]。面對(duì)日趨嚴(yán)峻的土壤惡化形勢(shì)，減輕農(nóng)藥對(duì)土壤的污染、尋求新的增產(chǎn)措施逐漸成為研究熱點(diǎn)。

DICTOR等[13]研究表明，乙草胺在土壤中的降解速度取決于土壤類型、溫度、施用量，而微生物降解是乙草胺在土壤中的主要降解方式。目前，國內(nèi)外對(duì)乙草胺降解菌的研究大多以乙草胺為著手點(diǎn)，集中在對(duì)降解菌的篩選、降解特性研究及降解途徑分析上，而關(guān)于對(duì)植物生長具有促進(jìn)作用的降解菌研究卻鮮見報(bào)道[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，P.indica對(duì)乙草胺藥害具有一定的緩解效果[15]，但未探明其對(duì)土壤及油菜中乙草胺殘留的影響。鑒于此，以P.indica為供試材料，進(jìn)一步探索P.indica對(duì)油菜乙草胺藥害的緩解機(jī)制，旨在尋找既可以促進(jìn)作物生長，提高作物產(chǎn)量，又可以加速土壤及植物中乙草胺降解的微生物，為土壤環(huán)境的修復(fù)與農(nóng)業(yè)增收增產(chǎn)提供理論依據(jù)和借鑒措施。

1 材料和方法

1.1 供試生物及試驗(yàn)材料

P.indica由德國耶拿大學(xué)RALF Oelmüller教授惠贈(zèng)。50%乙草胺乳油，由山東勝邦綠野化學(xué)有限公司生產(chǎn); 乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品購自國家標(biāo)準(zhǔn)樣品中心；93%乙草胺原藥，由山東喬昌化學(xué)有限公司生產(chǎn)；甲醇(HPLC)，由美國TEDIA公司生產(chǎn)；其他試驗(yàn)藥品材料均為市售。

1.2 試驗(yàn)儀器

主要儀器：7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)、DLSB-5/25 ℃低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、RE-52-AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、QXSX超聲波洗凈儀(天津市帕爾電子制冷科技有限公司)、FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、Florisil固相萃取柱(美國Agilent公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲生長速率法測(cè)定乙草胺對(duì)P.indica生長的影響 參照文獻(xiàn)[16]，將P.indica分別接種在含0、5、10、20、40、80、100、200 mg/L乙草胺的PDA培養(yǎng)基上，(28±1)℃培養(yǎng)1周后，測(cè)定菌落直徑大小。

菌落增長直徑=菌落直徑-菌碟直徑

(1)

生長速率抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落增長直徑)/對(duì)照菌落增長直徑×100%

(2)

1.3.2 懸浮培養(yǎng)法測(cè)定乙草胺對(duì)P.indica鮮質(zhì)量與干質(zhì)量的影響 將正常培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基中的印度梨形孢用打孔器打成7 mm的菌餅，分別接種在含0、5、10、20、40、80、100、200 mg/L乙草胺的PDB培養(yǎng)基中，(28±1)℃培養(yǎng)1周后，測(cè)定菌絲的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量。

鮮質(zhì)量抑制率=(對(duì)照菌絲鮮質(zhì)量-處理菌絲鮮質(zhì)量)/對(duì)照菌絲鮮質(zhì)量×100%

(3)

干質(zhì)量抑制率=(對(duì)照菌絲干質(zhì)量-處理菌絲干質(zhì)量)/對(duì)照菌絲干質(zhì)量×100%

(4)

1.3.3 GS-MS法測(cè)定P.indica菌液中乙草胺殘留動(dòng)態(tài) 將不同數(shù)量(0、1、3個(gè))的印度梨形孢菌餅接種在PDB培養(yǎng)基中，(28±1)℃培養(yǎng)3 d后，再分別加入不同質(zhì)量濃度的乙草胺藥液，使培養(yǎng)液中乙草胺的質(zhì)量濃度分別為20、50、100 mg/L，以未加入菌餅的PDB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照(CK1)。無菌條件下取樣后，參照文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行處理。

色譜條件：參考文獻(xiàn)[10]的方法，采用DB-5 MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫: 90 ℃保持1 min；以10 ℃/min升至150 ℃，保持 4 min；以5 ℃/min升至200 ℃，保持 3 min；再以10 ℃/min升至 250 ℃，保持2 min。

1.3.4 GS-MS法測(cè)定施有P.indica菌絲的土壤中乙草胺殘留動(dòng)態(tài) 將分別為0、1、2、4 g(鮮質(zhì)量)P.indica菌絲研磨均勻后定容到100 mL，均勻加入到700 g風(fēng)干過篩未受乙草胺污染的土壤中。再噴施不同質(zhì)量濃度的乙草胺，使土壤中乙草胺含量分別為50、100、200 mg/kg，保持水土濕潤，(20±1)℃下培養(yǎng)。于施藥后1、2、3、5、7、9、11、15 d，分別稱取5 g土壤進(jìn)行試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行處理。色譜條件同1.3.3。

1.3.5 GS-MS法測(cè)定P.indica拌種處理油菜幼苗中乙草胺殘留動(dòng)態(tài) 在塑料盆(長80 cm、寬25 cm、高15 cm)中加入定量過篩的風(fēng)干土，并用一定量水將其浸濕，每1 kg油菜籽分別用0、5、10、20 g的P.indica菌絲進(jìn)行拌種，并播種于已裝土的塑料盆中，播后1 d，用有效成分含量為600、1 200、1 800 g/hm2的乙草胺進(jìn)行土壤封閉，油菜播后4、6、8、10、15、21 d，取5 g油菜幼苗的地上部分，參照文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行處理。色譜條件同1.3.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙草胺對(duì)P.indica生長的影響

如表1所示，當(dāng)乙草胺質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，通過菌絲生長速率法測(cè)得乙草胺對(duì)P.indica生長速率的相對(duì)抑制率為6.19%，通過菌絲懸浮培養(yǎng)法測(cè)得乙草胺對(duì)P.indica鮮質(zhì)量的相對(duì)抑制率為9.38%，對(duì)干質(zhì)量的相對(duì)抑制率為17.40%；當(dāng)乙草胺質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，乙草胺對(duì)P.indica生長速率、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的相對(duì)抑制率分別為98.12%、95.11%、96.40%?？梢姡也莅穼?duì)P.indica的生長有一定影響，且隨著乙草胺質(zhì)量濃度升高，對(duì)P.indica生長的抑制作用越大。

表1 乙草胺對(duì)P.indica生長的影響Tab.1 Effect of acetochlor on the growth of P.indica

2.2 乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線及乙草胺含量測(cè)定方法的回收率

將乙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3.3色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，保留時(shí)間為17.415 min，以峰面積(Y)對(duì)乙草胺質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示，乙草胺質(zhì)量濃度為0.01～25 mg/L時(shí)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，線性方程為Y=41 042X-3 960.1(R2=0.999 8)?？梢姡撋V條件滿足乙草胺定量分析的需要。

在不含乙草胺的P.indica菌液樣品和土壤樣品中準(zhǔn)確加入(0.01～25 mg/kg) 乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.3、1.3.4、1.3.5中的方法分別進(jìn)行提取純化并測(cè)定菌液、土壤以及油菜幼苗中的乙草胺含量，計(jì)算回收率。結(jié)果(表2)表明，P.indica菌液中乙草胺的平均回收率為92.38%～94.68%，RSD均小于等于4.25%；土壤中乙草胺的平均回收率為83.54%～87.78%，RSD均小于等于4.57%；油菜中乙草胺的平均回收率為88.35%～91.53%，RSD均小于等于6.12%，符合農(nóng)藥殘留分析要求。

表2 乙草胺的添加回收率Tab.2 Addition recovery rate of acetochlor

2.3 乙草胺的降解動(dòng)態(tài)

2.3.1 乙草胺在P.indica菌液中的降解動(dòng)態(tài) 由表3可見，當(dāng)未添加P.indica菌餅，乙草胺質(zhì)量濃度分別為20、50、100 mg/L時(shí)，乙草胺的半衰期均為115.52 d；添加菌餅后，乙草胺半衰期明顯縮短，且均在9 d以下。

表3 乙草胺在P.indica菌液中的降解動(dòng)態(tài)Tab.3 Degradation dynamics of acetochlor in P.indica

2.3.2 乙草胺在土壤中的降解動(dòng)態(tài) 對(duì)乙草胺在土壤中的殘留量進(jìn)行回歸分析，其結(jié)果見表4。從表4可以看出，乙草胺在土壤中前期降解較快、后期降解較慢，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程ct=c0ekt。結(jié)果(表4)表明，未添加P.indica菌絲時(shí)，土壤中50、100、200 mg/kg乙草胺的半衰期分別為11.18、11.95、12.84 d。1 kg土壤中分別添加1、2、4 gP.indica菌絲后，土壤中50 mg/kg乙草胺的半衰期分別11.36、10.35、10.19 d，100 mg/kg乙草胺的半衰期分別11.36、11.18、11.36 d，200 mg/kg乙草胺的半衰期分別11.95、11.55、11.55 d，總體上表現(xiàn)為短于未添加菌絲時(shí)的半衰期。

表4 乙草胺在土壤中的降解動(dòng)態(tài)Tab.4 Degradation dynamics of acetochlor in soil

2.3.3 乙草胺在油菜幼苗中的降解動(dòng)態(tài) 試驗(yàn)結(jié)果(表5)表明，未添加P.indica菌絲時(shí)，施用量為600、1 200、1 800 g/hm2的乙草胺在油菜幼苗中的半衰期分別為3.83、3.65、3.07 d。每千克油菜籽分別采用5、10、20 gP.indica菌絲進(jìn)行拌種的處理，施用量為600 g/hm2的乙草胺在油菜幼苗中的半衰期分別為3.47、3.38、3.59 d，施用量為1 200 g/hm2的乙草胺在油菜幼苗中的半衰期分別為3.40、3.22、3.45 d，施用量為1 800 g/hm2的乙草胺在油菜幼苗中的半衰期分別為2.82、2.92、2.84 d。可見，通過P.indica拌種處理的油菜幼苗中，乙草胺的半衰期均有一定程度縮短。

表5 乙草胺在油菜植株中的降解動(dòng)態(tài)Tab.5 Degradation dynamics of acetochlor in rape

3 結(jié)論與討論

根部?jī)?nèi)生真菌P.indica比叢枝菌根真菌擁有更加廣泛的寄主范圍以及更廣譜的生物學(xué)效應(yīng)，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和商業(yè)開發(fā)前景，是目前農(nóng)用有益微生物的研究熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中乙草胺質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，對(duì)固體培養(yǎng)基中P.indica生長速率的相對(duì)抑制率為98.12%，對(duì)懸浮培養(yǎng)液中P.indica的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相對(duì)抑制率分別為95.11%和96.40%，說明乙草胺對(duì)P.indica的生長具有較大的不利影響；在不添加P.indica的懸浮培養(yǎng)液中，當(dāng)乙草胺質(zhì)量濃度分別為20、50、100 mg/L時(shí)，其半衰期均為115.52 d；添加P.indica菌餅后，乙草胺的半衰期縮短至9 d以下。每千克土壤添加2 gP.indica后，土壤中50、100、200 mg/kg乙草胺的半衰期分別為10.35、11.18、11.55 d，均低于未添加P.indica的半衰期(11.18、11.95、12.38 d)；說明P.indica對(duì)乙草胺的降解具有明顯的促進(jìn)作用；另外，P.indica菌液的質(zhì)量濃度對(duì)乙草胺的降解速率有一定影響，但影響較小；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，隨著土壤中乙草胺含量的升高，乙草胺的半衰期也有一定延長，推測(cè)是由于乙草胺影響土壤中微生物的生長代謝，使其降解變緩。除此之外，P.indica對(duì)油菜植株中乙草胺的降解具有促進(jìn)作用，這可能與其促進(jìn)油菜抗逆性、提高油菜中乙草胺的相關(guān)解毒酶活性有關(guān)；同時(shí)乙草胺高施用量(1 800 mg/hm2)處理中，乙草胺半衰期較短，推測(cè)與油菜自身對(duì)乙草胺的代謝有關(guān)，即在此質(zhì)量濃度下，油菜合成更多的解毒酶類物質(zhì)，促進(jìn)乙草胺加速代謝至自身可接受的較低濃度。

微生物是降解土壤中乙草胺的主要因素[20]，而目前國內(nèi)外乙草胺降解菌主要是通過富集篩選土壤中的微生物得到的，很可能在篩選過程中忽視了微生物對(duì)作物生長的影響。P.indica已被證明對(duì)多種作物具有促進(jìn)生長、提高產(chǎn)量、增強(qiáng)抗逆性等作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，P.indica對(duì)土壤及油菜植株中的乙草胺降解具有促進(jìn)作用，這或許能為P.indica菌肥的開發(fā)應(yīng)用提供新的思路，同時(shí)也為土壤環(huán)境的修復(fù)提供了參考。