劉 莉，姚 瑞，徐越仁，李慧向，張夢丹，胡圣偉

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

在牲畜物種中，排卵率和胚胎存活率是具有重要經(jīng)濟意義的指標[1]。綿羊是一種小型產(chǎn)仔動物，非常適合作為研究繁殖力基因的模型生物[2]。綿羊排卵率的遺傳變異已引起許多學(xué)者的關(guān)注，PURFIELD等[3]研究發(fā)現(xiàn)，不同綿羊品種之間排卵率存在顯著差異，并且在許多情況下，不同品種(系)之間存在異常差異。由于目前沒有進行定向選育，帶有多胎性能主效基因的個體數(shù)量較少，大多數(shù)還分散在群體之中。如果按照多胎綿羊的選育措施，加強本品種選育，建立核心群，就可以提高多胎性能基因型頻率，使多胎性能主基因固定下來。

綿羊生長分化因子(GDF9)是卵母細胞分泌的旁分泌因子，是早期卵泡形成以及綿羊卵巢中顆粒細胞和卵泡膜細胞的關(guān)鍵分化因子[4-7]。綿羊GDF9對早期卵泡的生長和發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用[8]，甚至這個卵母細胞衍生的生長因子會影響綿羊的排卵率[9-11]。前人將GDF9基因定位到綿羊第5條染色體上，基因跨度約為2.5 kb，由2個外顯子組成，由單個長為1 126 bp的內(nèi)含子分隔，編碼453個氨基酸殘基的前肽，活性成熟肽由135個氨基酸組成[12-14]。HANRAHAN等[14]通過PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析,在GDF9中已經(jīng)鑒定出8個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點(G1—G8)，其中有5個突變(G1、G4、G6、G7和G8)會導(dǎo)致氨基酸的改變。G1突變是在260位點處的堿基由G突變?yōu)锳，在外顯子1的氨基酸殘基87處，導(dǎo)致精氨酸向組氨酸的變化[12]，這種取代可能會影響成熟的GDF9蛋白的活性[15]。POLLEY等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因G1突變在加羅萊羊中具有多態(tài)性。隨后，KOLOSOV等[17]在俄羅斯綿羊品種中也鑒定出G1多態(tài)性，并發(fā)現(xiàn)其與綿羊多產(chǎn)相關(guān)聯(lián)。此外，在伊朗的Moghani、Ghezel綿羊[18]和印度的Garole綿羊[19]中也發(fā)現(xiàn)了GDF9基因G1突變。目前，國內(nèi)存在G1突變的綿羊品種包括小尾寒羊、湖羊、特克塞爾羊、德國肉用美利奴羊、陶賽特羊、洼地綿羊、杜泊羊以及巴音布魯克羊[20]。CHU等[21]通過PCR-SSCP研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因G1突變與小尾寒羊多胎性狀顯著相關(guān)，對于小尾寒羊中的G1突變，基因型AA的第1胎和第2胎的最小產(chǎn)仔數(shù)均較基因型AG多。因此，建立快速、準確的可視化檢測綿羊GDF9基因G1突變的方法可為多胎綿羊的選育提供參考。

目前，檢測綿羊GDF9基因G1突變的方法主要有聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)[17-18,20]、PCR-SSCP[21]等，但是這些方法在準確度、成本、勞動力和時間消耗等方面存在不足。為此，研究通過將改良的擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)與核酸染料SYBR Green Ⅰ結(jié)合，以期快速可視化檢測出具有經(jīng)濟性狀的候選基因GDF9基因G1突變。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣本 樣本于2018年10月采集自新疆石河子市某屠宰場，包括2個小尾寒羊子宮樣本和25個小尾寒羊肌肉樣本。其中，子宮樣本采集自懷孕母羊，1個子宮樣本中只有1只羊羔，另1個子宮樣本中有2只羊羔。將所有樣本分別置于凍存管內(nèi)并貼標簽后放在-20 ℃的環(huán)境中保存。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix購自天根生化科技(北京)有限公司；ExTaq酶、DL500 DNA Marker、10×Loading Buffer購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；SYBR Green Ⅰ(10 000×濃縮液)購自索萊寶科技(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取采集樣本的基因組DNA，并將DNA保存在無菌水中。采用瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白質(zhì)檢測儀(ND 2000)檢測以確定提取的DNA的質(zhì)量。

1.2.2 引物設(shè)計 參考GenBank公布的綿羊GDF9基因(NC_040256.1)序列，使用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計ARMS特異性引物，根據(jù)ARMS的原理，使下游引物3′端的最后1個堿基與G1突變位點(rs410123449)互補，下游引物3′端的最后1個堿基是T而不是C。分別在下游引物3′末端的第2、3、4位堿基處引入1個額外的錯配以提高引物的特異性(表1、圖1)。具有額外錯配的引物對于突變型模板來說只存在1個錯配，然而對于野生型模板來說，引物與模板之間存在2個錯配，鏈延伸反應(yīng)會因磷酯鍵形成困難而受阻。篩選4對引物中只擴增突變型，而不擴增野生型樣本的最佳引物對。

表1 用于檢測GDF9基因G1突變的ARMS引物序列及其反應(yīng)條件Tab.1 ARMS primers sequences used to detect G1 mutation of GDF9 gene and their reaction conditions

圖1 ARMS引物設(shè)計原理 Fig.1 Design principle of ARMS primers

此外，針對綿羊GDF9基因G1突變設(shè)計1對常規(guī)引物，用于樣本的測序。引物序列為F：5′-TCCTATTAGCCTTGATTCTCTG-3′；R：5′-TGCTCCTACACACCTGCC-3′，預(yù)計擴增片段為354 bp。引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 ARMS PCR及最佳引物對的篩選 采用ARMS檢測GDF9基因G1突變，以20 μL反應(yīng)體積進行ARMS PCR。每個反應(yīng)均包括0.1 μL ExTaq(5 U/μL)、1.6 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)、1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)、2 μL 10× PCR Buffer(Mg2+free)、0.5 μL 0.1 μmol/L上游引物、0.5 μL 0.1 μmol/L下游引物、1 μL 綿羊的基因組DNA，最后加入ddH2O將反應(yīng)體積補至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度(表1)復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并用分子成像儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]拍照。

將已知產(chǎn)羔數(shù)并通過測序驗證基因型的懷孕母羊的子宮樣本基因組DNA與設(shè)計的特異性引物進行如上所述的ARMS擴增，以ddH2O代替基因組DNA作為陰性對照，通過電泳篩選出反應(yīng)最佳的引物對。

1.2.4 ARMS和SYBR Green Ⅰ結(jié)合可視化檢測GDF9基因G1突變 利用篩選的最佳引物對進行GDF9基因G1突變的可視化檢測。所使用的模板與引物篩選使用的模板相同，以ddH2O代替模板作為陰性對照。ARMS PCR結(jié)束后，向PCR產(chǎn)物中加入SYBR Green Ⅰ，混勻后立刻用肉眼觀察PCR管中顏色的變化，并拍照記錄。

1.2.5 可視化檢測系統(tǒng)的準確度檢測 對25個小尾寒羊樣本進行了GDF9基因G1突變的可視化檢測，以已知產(chǎn)羔數(shù)和基因型的樣本作為參考，以ddH2O代替模板作為陰性對照。同時，將25個樣本的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，初步驗證可視化檢測結(jié)果。此外，將25個樣本送到北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，以驗證可視化檢測的準確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDF9基因G1突變可視化檢測最佳引物對的篩選

從圖2可以看出，所有引物都可以對突變型樣本的基因組進行擴增，然而在距離下游引物3′端的第2(F2)和第4位(F4)堿基處具有額外錯配的引物，尤其是不具有額外錯配的引物(F0)都能對野生型樣本基因組進行擴增。當(dāng)額外的錯配位于下游引物3′端的第3位堿基處時(F3)，特異性引物只對突變型樣本的基因組進行擴增，而不擴增野生型樣本基因組，且擴增產(chǎn)物的條帶清晰?？梢?，F(xiàn)3是可用于可視化檢測的最佳引物對。

M：DL500 DNA Marker；NC：陰性對照；1、2：F0對野生型、突變型綿羊基因組擴增結(jié)果；3、4：F2對野生型、突變型綿羊基因組擴增結(jié)果；5、6：F3對野生型、突變型綿羊基因組擴增結(jié)果；7、8：F4對野生型、突變型綿羊基因組擴增結(jié)果M:DL500 DNA Marker;NC:Negative control;1,2:The results of F0 amplification of genome DNA of wild type and mutant genotype,respectively;3,4:The results of F2 amplification of genome DNA of wild type and mutant genotype,respectively;5,6:The results of F3 amplification of genome DNA of wild type and mutant genotype,respectively;7,8:The results of F4 amplification of genome DNA of wild type and mutant genotype,respectively圖2 ARMS引物PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of ARMS primers

2.2 GDF9基因G1突變可視化檢測結(jié)果

ARMS PCR后，向PCR產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ，可以在突變型中觀察到明顯的顏色變化(圖3)。野生型與陰性對照都沒有發(fā)生顏色變化，顯示SYBR Green Ⅰ 原本的顏色即橙黃色，然而突變型模板與引物發(fā)生特異性擴增，其產(chǎn)物與SYBR Green Ⅰ 結(jié)合后使SYBR Green Ⅰ的顏色變?yōu)榱辆G色。

A：可視化檢測綿羊GDF9基因G1突變野生型和突變型；B：與可視化檢測結(jié)果對應(yīng)的電泳結(jié)果。M:Marker;NC：陰性對照；1：野生型樣本；2：突變型樣本A:Visual detection of wild type and mutant genotype of G1 mutation of GDF9 gene in sheep;B:Electrophoresis results corresponding to visual detection results.M:Marker;NC:Negative control;1:Wild type sample;2:Mutant uype sample圖3 綿羊GDF9基因G1突變可視化檢測Fig.3 Visual detection results of G1 mutation of GDF9 gene in sheep

2.3 GDF9基因G1突變可視化檢測系統(tǒng)的準確度

采用建立的可視化檢測綿羊GDF9基因G1突變的方法檢測小尾寒羊樣本，結(jié)果顯示，野生型和突變型樣本之間顏色變化明顯，可視化檢測結(jié)果與電泳結(jié)果一致(圖4)。25個樣本中，有9個樣本被檢測為突變型，16個樣本被檢測為野生型，可視化檢測結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，可視化檢測方法的準確度高達100%(表2)。結(jié)果表明，ARMS與SYBR Green Ⅰ結(jié)合的可視化檢測有很好的穩(wěn)健性，每個樣本檢測成本低于3元。

A、 B：可視化檢測10個小尾寒羊樣本；C、D：與可視化檢測結(jié)果對應(yīng)的電泳結(jié)果。NC：陰性對照；1—10：分別代表表2中序號1—10樣本；WT：已知野生型樣本；MT：已知突變型樣本A,B:10 small tail han sheep samples for visual detection;C,D:Electrophoresis results corresponding to visual detection results.NC:Negative control;1—10:Represent samples with serial numbers 1—10 in Tab.2,respectively;WT:Known wild type sample;MT:Known mutant genotype sample圖4 可視化檢測10個小尾寒羊樣本GDF9基因G1突變Fig.4 Visual detection results of G1 mutations of GDF9 gene of 10 small tailed Han sheep samples

表2 可視化檢測25個小尾寒羊樣本GDF9基因G1突變及對應(yīng)的測序基因型Tab.2 Visual detection results of G1 mutation of GDF9 gene and corresponding sequencing genotypes of 25 small tailed Han sheep samples

3 結(jié)論與討論

目前，最常用的檢測ARMS擴增的方法是瓊脂糖凝膠電泳，該方法操作繁瑣，且需要借助電泳儀等設(shè)備[22]。相比較而言，染料分析的方法既提高了肉眼的識別率，又有望應(yīng)用于現(xiàn)場的檢測，是最為簡單方便的結(jié)果判定方式[23-25]。本研究選擇SYBR Green Ⅰ核酸染料，向PCR產(chǎn)物中加入染料后，可通過觀察PCR管內(nèi)的顏色變化來判斷其是否擴增成功，進而判斷樣本是否含有GDF9基因G1突變。采用SYBR Green Ⅰ檢測ARMS擴增，其原理是SYBR Green Ⅰ能嵌入雙鏈DNA(Double-stranded DNA，dsDNA)雙螺旋小溝區(qū)域，其在游離狀態(tài)下發(fā)出很弱的熒光，然而當(dāng)其與dsDNA結(jié)合后，熒光強度大大增強，可以利用其熒光強度變化來檢測核酸擴增。此外，當(dāng)SYBR Green Ⅰ含量較高時，自然光條件下呈現(xiàn)橙黃色，當(dāng)其與dsDNA結(jié)合后則會顯現(xiàn)為亮綠色。PCR反應(yīng)結(jié)束后，直接將SYBR Green Ⅰ加入PCR產(chǎn)物中，混勻后直接觀察PCR管內(nèi)顏色的變化，攜帶有GDF9基因G1突變的樣本呈亮綠色，反之則為橙黃色。

GDF9和BMP15基因?qū)ε怕崖?、卵母細胞健康和妊娠的建立起著至關(guān)重要的作用[26]。CRAWFORD等[27]研究發(fā)現(xiàn)，裸卵(Denuded oocyte，DO)中GDF9與BMP15基因表達水平的比值與物種間繁殖率有關(guān)。BMP15、GDF9基因不僅具有較高的同源性、相似的結(jié)構(gòu)及在卵巢中類似的表達模式，而且在功能上也密切相關(guān)，通常表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。CHANG等[28]在母羊中發(fā)現(xiàn)，GDF9、BMP15基因共存突變對排卵率具有累積影響。GDF9和BMP15基因共同突變母羊的排卵率高于GDF9或BMP15基因單個突變母羊的排卵率[29]。在今后的研究中，檢測綿羊的GDF9基因突變的同時，還要檢測綿羊的BMP15基因的突變，以篩選出繁殖力尤其突出的綿羊進行下一步的培育。

本研究將核酸染料SYBR Green Ⅰ與改良的ARMS一起應(yīng)用于可視化檢測綿羊的GDF9基因G1突變，突變型顯現(xiàn)亮綠色而野生型顯現(xiàn)為橙黃色，建立的檢測方法可直觀檢測GDF9基因G1突變，且準確度達到100%。