郝瑩瑩，于佳斌，練旭冬，謝丹萍，毛瑩瑩，劉曉冬，賀鑫梅，金成浩，申貴男*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

紫草為多年生傳統(tǒng)中藥材，可治療丹毒、燒傷等疾病[1]，其中以紫草素(Shikonin)為主要代表的萘醌類化合物是紫草中含量較多的化學(xué)活性成分[2]。萘醌類化合物具有包括抗癌、抗氧化在內(nèi)的多種生理藥理功能，但除了外用的燒燙傷治療劑外，尚未得到廣泛的臨床應(yīng)用[3-5]。

多項研究表明，萘醌類衍生物在生物體內(nèi)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的方式抑制體內(nèi)腫瘤和癌癥細(xì)胞的生長[6-7]。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯可以通過多種關(guān)鍵信號蛋白介導(dǎo)，例如P53與MAPKs(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)家族蛋白[8-9]。紫草素可以使黑色素瘤細(xì)胞A375-S2的P53蛋白表達(dá)量增加，增高的P53蛋白激活促凋亡蛋白質(zhì)Bax，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞線粒體大量釋放細(xì)胞色素c激活caspase家族蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴的細(xì)胞凋亡[10-11]。多項研究還表明MAPKs信號通路在細(xì)胞增殖、分化以及凋亡的過程中均起到重要調(diào)節(jié)作用[12]。前期研究表明，紫草素及其衍生物的生物活性主要來自于萘環(huán)羰基的親電作用，通過結(jié)構(gòu)修飾提高萘醌類衍生物的選擇性并降低細(xì)胞毒性是化學(xué)合成的主要研究方向[13-15]，羥基的甲基化正可大大降低萘醌母核5,8位羥基的較強細(xì)胞毒性[3]。

本實驗設(shè)計合成了兩種不同長度的2-取代萘醌類衍生物，對肺癌細(xì)胞A549的抗癌活性進(jìn)行評價后探究了活性較強的2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮 (a) 抑制A549細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的分子機制，以及不同長度，不同取代基基團(tuán)對萘醌類衍生物構(gòu)效關(guān)系有何影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞系 A549 使用黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞庫的凍存細(xì)胞。

1.2 試劑及儀器

1,4-二甲氧基苯、馬來酸酐、無水三氯化鋁、對甲苯磺酸甲酯、氯化鈉、濃鹽酸、石油醚60-90、無水碳酸鈉、鄰二氯苯、正辛硫醇、正辛胺、濃硫酸、重鉻酸鈉、間氯過氧苯甲酸、碳酸氫鈉、二甲基亞砜、無水硫酸鈉均購自阿拉丁公司。DMEM/高糖(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；抗p-JNK、p-ERK、p-P38、JNK、ERK、P38、P53、P21(Sigma-Aldrich)；Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E、α-tubulin抗體(Santa Cruz公司)；硝酸纖維素膜(Millipore公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒(Sigma-Aldrich)；MTT(Amresco公司)；NC膜(PALL公司)；ECL(Thermo公司)；培養(yǎng)皿(NEST公司)；蛋白免疫印跡系統(tǒng)(Amersham Bioscience公司)；PE SCIX API2000 MS/MS質(zhì)譜分析儀(SCIEX公司)；AVANCE DPX-400 超導(dǎo)核磁共振譜儀(布魯克公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO)；多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司)。

1.3 化合物合成

化合物的中間體5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮以1,4-二甲氧基苯和馬來酸酐為原料同三氯化鋁、氯化鈉155 ℃熔融反應(yīng)獲得5,8-二羥基萘-1,4-二酮，利用甲基化試劑對甲苯磺酸甲酯、碳酸鈉進(jìn)行甲基化獲得[17]。

1.3.1 2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(a)的合成

將5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(266.2 mg,1.22 mmol)溶于30 mL甲醇、加正辛硫醇(212.1 mg,1.45 mmol)，室溫攪拌6 h，加入濃硫酸(5 mL)和重鉻酸鈉(223.5 mg,0.75 mmol)的混合水溶液25 mL，繼續(xù)攪拌2 min，氯仿萃取，脫水濃縮干燥后，乙醇重結(jié)晶得2-辛巰基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮。

將2-辛巰基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(442.2 mg,0.35 mmol)溶于30 mL氯仿。分4次加入間氯過氧苯甲酸(65.6 mg,0.38 mmol)，0 ℃反應(yīng)，薄層層析法觀察反應(yīng)進(jìn)程，至2-辛巰基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮反應(yīng)完畢，立即加入10 %碳酸氫鈉水溶液(5 mL)終止反應(yīng)。加入飽和氯化鈉水溶液(30 mL)利用氯仿提取兩次，脫水濃縮干燥后，硅膠柱層析得2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘1,4-二酮(a)。

1.3.2 2-辛胺基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(b)

將5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(266.2 mg,1.22 mmol)溶于30 mL甲醇、加正辛胺(187.4 mg,1.45 mmol)，室溫攪拌6 h，加入濃硫酸(5 mL)和重鉻酸鈉(223.5 mg,0.75 mmol)的混合水溶液25 mL，繼續(xù)攪拌2 min，氯仿萃取，脫水濃縮干燥后，硅膠柱層析得2-辛胺基-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(b)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將從液氮取出的肺癌細(xì)胞(A549)復(fù)蘇后培養(yǎng)于CCM高糖培養(yǎng)基內(nèi)(CCM高糖培養(yǎng)基含10 %滅活的胎牛血清和1 %青霉素/鏈霉素)，將細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h，24 h后可進(jìn)行細(xì)胞換液，48h后可進(jìn)行細(xì)胞傳代(環(huán)境保持37 ℃、5% 的CO2及飽和濕度)。

1.5 MTT檢測細(xì)胞增殖抑制

將第3代對數(shù)生長期狀態(tài)良好，形態(tài)飽滿的A549細(xì)胞接種于96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×104個mL-1)，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的化合物a和b繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后每孔加入10 μL的MTT試劑(5 mg/mL)輕柔混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后棄去除上層培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，37℃孵育15 min，15 min后輕柔吹打混勻，酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處溶液吸光值。

1.6 增殖曲線繪制

將第3代對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好，形態(tài)飽滿的A549細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×104個mL-1)，培養(yǎng)24 h，分別于第1、3、5和7天每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h。4h后棄除上層培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，37℃孵育15 min，15 min后輕柔吹打混勻，酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處溶液吸光值后將吸光值匯總分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法分析

將藥物處理后的細(xì)胞離心回收，加入提前配制好的蛋白質(zhì)裂解液將細(xì)胞混勻使其裂解，離心20 min (12000 r/min、4 ℃)，回收蛋白質(zhì)上清。將15 μg的總蛋白在12 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行凝膠電泳，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉后用抗p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-P38、P38、P53、P21、Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B1和α-tubulin一抗(1:2000)在4 ℃下孵育過夜。棄去一抗后用TBST緩沖液(含0.2 % Tween-20、15 mmol/L 氯化鈉和10 mmol/L Tris-Hcl)洗滌5次，每次5 min，與HRP標(biāo)記二抗(鼠或兔、1∶5000)孵育2 h，洗膜、ECL顯色、成像并分析結(jié)果。

1.8 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測實驗均參照試劑盒說明進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用繪圖軟件SigmaPlot繪圖，多組均數(shù)采用t檢驗進(jìn)行比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01為有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.001為有極其顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 萘醌類衍生物的合成與鑒定

2-Octylsulfinyl-5,8-dimethoxy-naphthalene-1,4-dione (a):1H NMR (CDCl3,400 MHz) δ 7.41 (d,J = 9.2 Hz,1H),7.36 (d,J = 9.6 Hz,1H),7.30 (s,1H),3.99 (s,6H),3.23 (m,1H),2.90 (m,1H),1.90 (m,1H),1.64 (m,1H),1.45 (m,2H),1.25 (m,8H),0.87 (t,J = 7.2 Hz,3H); ESI-MS: m/z 400.8 (M+Na)+。

2-Octylamino-5,8-dimethoxy-naphthalene-1,4-dione (b):1H-NMR (CDCl3,400 MHz) δ 7.34 (d,J = 9.6 Hz,1H),7.18 (d,J = 9.6 Hz,1H),5.69 (br,1H),5.61 (s,1H),3.96 (s,3H),3.94 (s,3H),3.11 (q,J=6.8 Hz,2H),1.68～1.61 (m,2H),1.41-1.20 (m,10H),0.88 (t,J=6.4 Hz,3H); m/z 346 (M+H)+。

根據(jù)波譜學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2種產(chǎn)物為目標(biāo)化合物。化合物的合成路線如下(Fig.1)。

圖1 萘醌類衍生物a、b的合成路線

2.2 化合物a對A549細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用

為檢測含有不同取代基的萘醌類衍生物對A549細(xì)胞的增殖抑制效果，以1、3、5、7、9、11、13、15μmol/L濃度的2種萘醌類化合物處理A549細(xì)胞24 h，通過MTT assay的方法對A549細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(圖2)。結(jié)果顯示，化合物a濃度依賴性的抑制A549細(xì)胞；而化合物b在各濃度梯度均未顯示出抑制活性。說明不同取代基(辛亞砜與辛胺基)對萘醌類衍生物的抗癌活性影響較大，巰基取代顯示較好的抑制A549細(xì)胞增殖活性，而氨基取代導(dǎo)致化合物不能抑制A549細(xì)胞的增殖能力。

圖2 萘醌類衍生物對A549細(xì)胞活力影響 MTT法檢測A549細(xì)胞活力.***P<0.001,compared with control (0 μmol/L) group

2.3 化合物a抑制A549細(xì)胞增殖并導(dǎo)致G0/G1期阻滯

上述結(jié)果證明化合物a對A549細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，隨后通過3 μmol/L 化合物a處理A549細(xì)胞繪制出的生長曲線(圖3A)，以及0、3、8、12 μmol/L 濃度處理A549細(xì)胞6 h的細(xì)胞周期變化情況(圖3B)可知，化合物a在3 μmol/L濃度下對A549細(xì)胞增殖具有顯著地抑制作用。細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)顯示，化合物a可導(dǎo)致A549細(xì)胞發(fā)生顯著的G0/G1期阻滯，且阻滯百分比呈藥物濃度依賴性。

圖3 化合物a抑制A549增殖和G0/G1細(xì)胞周

期阻滯 (A)3 μmol/L化合物a處理A549細(xì)胞繪制生長曲線；***P<0.001,與空白對照組(0 μmol/L) 比較 (B) 檢測0、3、8、12 μmol/L 化合物a處理A549細(xì)胞6 h的細(xì)胞周期變化情況。

2.4 化合物a對A549細(xì)胞P53、MAPKs和細(xì)胞周期蛋白的影響

P53作為體內(nèi)的抑癌基因，在正常細(xì)胞中表達(dá)較少，但是其在防止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著非常重要的角色，P53蛋白可與P21基因調(diào)節(jié)區(qū)相互結(jié)合，激活P21基因轉(zhuǎn)錄，抑制Cyclin D，CDK4/6復(fù)合體和CyclinE導(dǎo)致細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G1期[18]。MAPKs信號通路也可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期阻滯以及細(xì)胞因子的分泌等過程。因此對P53及MAPKs的檢測有助于深入探討2-辛亞砜-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮的結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系。經(jīng)過檢測0、3、8、12 μmol/L 化合物a處理6 h后A549細(xì)胞的P53/P21信號關(guān)鍵蛋白，MAPKs信號通路關(guān)鍵蛋白以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(圖4)。結(jié)果顯示，P53，P21的表達(dá)水平和P38，ERK的磷酸化水平以及多種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平都隨化合物濃度的增加而顯著增加，但是JNK的磷酸化水平無明顯變化。以上結(jié)果顯示，化合物a可激活A(yù)549細(xì)胞中P53、P38和ERK信號通路。

圖4 化合物a對A549細(xì)胞P53、MAPKs和細(xì)胞周期蛋白的影響

2.5 化合物a可導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡

萘醌類化合物可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡，通過檢測化合物a對A549細(xì)胞凋亡的影響(圖5)。顯示，在6 h處理時，化合物a并不會引起細(xì)胞凋亡(圖5A)，這與之前細(xì)胞周期Sub/G0期的變化相一致(圖3)，但是結(jié)果顯示相應(yīng)的信號通路已經(jīng)被激活(圖5B)。因此延長處理時間來檢測A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的情況，結(jié)果顯示，在較長時間處理(12 h、24 h、48 h)處理時，部分A549細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，并且隨處理時間的延長凋亡的細(xì)胞逐漸增多(圖5C、D)。以上結(jié)果證明，化合物a可顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。

圖5 化合物a對A549細(xì)胞凋亡的影響 (A)和(C)AnnexinV染色法檢測A549細(xì)胞凋亡水平；(B)和(D)檢測細(xì)胞凋亡信號通路

3 討論

萘醌類衍生物具有良好的抗腫瘤活性，實驗通過MTT法明確化合物a對A549細(xì)胞很強的生長抑制作用，它可以使A549細(xì)胞發(fā)生G0/G1期的細(xì)胞周期阻斷，并隨著處理時間的延長有部分細(xì)胞會發(fā)生凋亡；從時間的先后順序以及細(xì)胞周期的結(jié)果可以看出，化合物a先導(dǎo)致細(xì)A549細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，隨著處理時間的延長，細(xì)胞無法突破細(xì)胞周期阻滯隨后發(fā)生了細(xì)胞凋亡。A549細(xì)胞會大量的表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白使其突破細(xì)胞周期的限制快速增殖，而化合物a通過p21抑制周期相關(guān)蛋白質(zhì)的活性使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，但相關(guān)細(xì)胞周期蛋白代償性的表達(dá)量增多，因此可以看出化合物a可抑制細(xì)胞增殖?；衔颽值得進(jìn)一步修飾，并在多種腫瘤細(xì)胞上評價其抗癌活性。

化合物b在相同的濃度下沒有表現(xiàn)出對A549細(xì)胞的抑制作用，說明2位的胺基大幅降低了該化合物對A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這是也非常有意義的發(fā)現(xiàn)。首先，這兩種化合物結(jié)構(gòu)非常相似，不同之處只在于2位的取代基，這一發(fā)現(xiàn)可以給今后的萘醌類衍生物修飾提供理論依據(jù)；其次，雖然化合物b對A549細(xì)胞沒有增殖抑制作用，因為沒有毒性可在其它領(lǐng)域如抗炎、抗老化方面檢測活性，做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，化合物a能夠激活P53和MAPKs信號通路導(dǎo)致A549細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞周期發(fā)生周期阻滯，進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡，抑制了A549細(xì)胞增殖?；衔颾在相同濃度下沒有抑制A549細(xì)胞增殖的作用，說明萘醌2-位的巰基取代相對于氨基取代顯示較好的抗癌活性。此結(jié)論為萘醌類衍生物的構(gòu)效關(guān)系研究提供了重要的理論依據(jù)，為萘醌類衍生物抗腫瘤藥物的篩選與合成提供了新的思路。