孫建禮, 朱青青, 劉飛, 趙果

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、河南省口腔醫(yī)院口腔外科(河南鄭州 450000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)又稱口腔鱗癌，是常見(jiàn)的口腔黏膜惡性腫瘤，具有局部浸潤(rùn)、高復(fù)發(fā)及高轉(zhuǎn)移的特性，常伴有頸部的淋巴轉(zhuǎn)移[1-2]?？谇击[癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍沒(méi)有特定的分子靶向藥物應(yīng)用于臨床[3]。造血基質(zhì)-1相關(guān)蛋白X-1 (HS1-associated protein X-1，HAX-1)首次被發(fā)現(xiàn)于1997年，HAX-1 是一種抗凋亡蛋白，導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，同時(shí)其在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲中發(fā)揮重要作用[4-6]。報(bào)道表明， HAX-1在惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。如食管癌、鼻咽癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌等[7-9]。目前為止，還鮮見(jiàn)HAX-1對(duì)口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展作用的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討HAX-1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 組織樣本收集于2014年6月至2015年12月間，于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔外科完成，其中口腔鱗狀細(xì)胞癌患者樣10例、癌旁組織標(biāo)本10例?；颊咝g(shù)前未接受治療。男7例，女3例，年齡50～58歲。7例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。每例標(biāo)本于離體20 min內(nèi)分別在癌灶區(qū)、癌旁3 cm處取材，取材后迅速凍于液氮中。通過(guò)Western blot檢測(cè)多種興趣蛋白(如DNA結(jié)合抑制因子4，鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白6及HAX-1)表達(dá)水平。

1.2 試劑或材料 TSCCA和Tca8223購(gòu)自中國(guó)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所；MTT購(gòu)自華美生物工程有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；HAX-1兔多抗、AKT兔多抗、AKT兔單抗(phospho S473)、c-myc兔單抗、GAPDH兔單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；PVDF膜購(gòu)自美Millipore公司；BrdU試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；transwell細(xì)胞侵襲試劑盒購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞TSCCA和Tca8223在含有10% FBS、1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃， 5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.2 Western Blot檢測(cè) 收集組織(利用研缽和液氮將其粉碎)和細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上反應(yīng)20 min后收集蛋白。取上清液進(jìn)行蛋白定量。取25 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，利用半干法將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉有蛋白的PVDF膜2 h后加入一抗：HAX-1兔多抗(1∶600)、AKT兔多抗(1∶700)、AKT兔單抗(1∶800，phospho S473)、c-myc兔單抗(1∶800)或GAPDH兔單抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育1.5 h，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。GAPDH為內(nèi)參對(duì)照蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為重復(fù)3次的平均值。

1.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 TRizol處理細(xì)胞提取待測(cè)細(xì)胞的總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)成cDNA，PCR擴(kuò)增c-Myc(GenBank accession number NM_002467)全長(zhǎng)(包括酶切位點(diǎn)XhoⅠ和EcoRⅠ)，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與質(zhì)粒pcDNA.3.1同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化到DH5a中擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆，鑒定，測(cè)序，將正確的質(zhì)粒命名為pcDNA.3.1-c-myc。將HAX-1 siRNA(5′-CCA CGA TAA CTT CGG CTT T-3′，0.3 μg)、non-specific siRNA(0.3 μg)、pcDNA.3.1-c-myc(0.3 μg)和pcDNA.3.1(0.3 μg)分別與0.6 μL Turbofect混勻，而后轉(zhuǎn)染進(jìn)入于96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，37℃， 5% CO2孵育， 24 h后利用Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 監(jiān)測(cè)指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)活力測(cè)定 將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞轉(zhuǎn)染于5%CO2，37 ℃的條件下孵育24 h。向各孔分別加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，于上述培養(yǎng)環(huán)境下孵育 6 h。最后，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光值。結(jié)果為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

1.4.2 Bromodeoxyuridine (BrdU) 檢測(cè) 將細(xì)胞接種于96孔板進(jìn)行，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，利用BrdU ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，操作步驟參考說(shuō)明書(shū)。首先每孔加入15 μL BrdU，5%CO2，37 ℃孵育2 h。用100 μL變性溶液換掉上清并孵育細(xì)胞10 min。按照說(shuō)明書(shū)相繼加入BrdU抗體、二抗和四甲基聯(lián)苯胺孵育30 min。經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè) 370 nm 的吸光度以反映細(xì)胞增殖的變化。每組樣品準(zhǔn)備3個(gè)復(fù)孔， 每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲能力通過(guò)細(xì)胞侵襲試劑盒檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算出侵襲到濾膜背面的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 OSCC中HAX-1表達(dá)量升高 利用Western blot方法檢測(cè)OSCC組織中HAX-1的表達(dá)量，結(jié)果顯示，OSCC組織中HAX-1的蛋白表達(dá)量較癌旁組織顯著升高(圖1)。

注：*與癌旁組織組比較 P<0.01

2.2 干擾HAX-1表達(dá)抑制OSCC細(xì)胞的活力和增殖能力 首先，轉(zhuǎn)染HAX-1 siRNA到細(xì)胞中干擾HAX-1的表達(dá)。結(jié)果表明，HAX-1 siRNA組中HAX-1的蛋白表達(dá)量較non spe siRNA組顯著降低，表明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功(圖2-A)。然后，我們利用MTT和BrdU實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力和增殖能力。結(jié)果顯示，HAX-1 siRNA組的細(xì)胞活力(圖2-B)和增殖能力(圖2-C)較non spe siRNA組均明顯降低。

2.3 干擾HAX-1降低OSCC細(xì)胞的侵襲能力 利用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾HAX-1對(duì)OSCC細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果表明HAX-1表達(dá)被抑制后可有效降低OSCC細(xì)胞的侵襲能力(圖3)。

2.4 HAX-1可通過(guò)AKT磷酸化調(diào)節(jié)c-myc的表達(dá) Western blot檢測(cè)表明，干擾HAX-1的蛋白

注：control:正常OSCC細(xì)胞；HAX-1 siRNA: 轉(zhuǎn)染HAX-1 siRNA的OSCC細(xì)胞； non spe siRNA: 轉(zhuǎn)染non-specific siRNA的OSCC細(xì)胞;A: TSCCA(左)和Tca8223(右)中HAX-1蛋白質(zhì)表達(dá)量；B: 細(xì)胞活力測(cè)定；C: 細(xì)胞增殖能力測(cè)定; 與non spe siRNA組比較*P<0.05，**P<0.01

注：*與non spe siRNA組比較P<0.01

表達(dá)可顯著降低AKT磷酸化水平和c-myc蛋白表達(dá)量(圖4-A)。為了進(jìn)一步研究OSCC細(xì)胞中HAX-1對(duì)AKT活化和c-myc表達(dá)的調(diào)控，我們利用AKT激動(dòng)劑SC79(0、1、1.5 和2 μg/mL)分別孵育干擾了HAX-1的OSCC細(xì)胞24 h。我們發(fā)現(xiàn)，SC79(1.5和2 μg/mL)顯著提高了AKT的磷酸化水平(圖4-B)。同時(shí)，SC79(1.5和2 μg/mL)也明顯促進(jìn)了c-myc的蛋白表達(dá)量(圖4-B)?？梢?jiàn)，AKT磷酸化水平的升高可阻礙HAX-1被干擾后對(duì)c-myc表達(dá)量的影響。因此，HAX-1可通過(guò)AKT磷酸化調(diào)節(jié)c-myc的表達(dá)。

2.5 HAX-1可調(diào)節(jié)c-myc的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖和侵襲 轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1-c-myc到干擾了HAX-1的OSCC細(xì)胞，結(jié)果顯示HAX-1 si-c-myc組中c-myc的蛋白表達(dá)量較HAX-1 si-pc組增加兩倍，說(shuō)明過(guò)表達(dá)成功(圖5-A)。另外，我們發(fā)現(xiàn)HAX-1 si-c-myc組細(xì)胞活力(圖5-B)，增殖(圖5-C)和侵襲(圖5-D)能力較HAX-1 si-pc組顯著升高。因此c-myc過(guò)表達(dá)可有效阻礙HAX-1干擾對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和侵襲能力的作用。

注：HAX-1 si+0、1、1.5、2 μg/mL: SC79(0、1、1.5、或2 μg/mL)孵育干擾了HAX-1的細(xì)胞。A: 干擾HAX-1后p-AKT和c-myc表達(dá)量變化；B: SC79孵育細(xì)胞后p-AKT和c-myc表達(dá)量變化；與non-spe siRNA組比較*P<0.05,**P<0.01;△與HAX-1 si+0 μg/mL組比較P<0.01

3 討論

口腔癌是世界第6大致死性惡性腫瘤，其中約90%為OSCC，近年來(lái)OSCC發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[10-11]。由于OSCC具有極易早期轉(zhuǎn)移的臨床特征，OSCC患者的5年生存率仍不足50%[12-13]。降低OSCC細(xì)胞的增殖遷移能力，將有助于OSCC的治療。

注：HAX-1 si-c-myc.轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1-c-myc到干擾了HAX-1的OSCC細(xì)胞；HAX-1 si-pc: 轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1到干擾了HAX-1的OSCC細(xì)胞;A: TSCCA(左)和Tca8223(右)中c-myc蛋白質(zhì)表達(dá)量；B: 細(xì)胞活力測(cè)定；C: 細(xì)胞增殖能力測(cè)定；D: 細(xì)胞侵襲能力測(cè)定; 與HAX-1 si-pc組比較*P<0.05，**P<0.01

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HAX-l存在于多種組織中，通過(guò)與多種蛋白作用參與或介導(dǎo)細(xì)胞骨架組件的形成，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附及轉(zhuǎn)移等過(guò)程[7]。You等[14]研究發(fā)現(xiàn)HAX-1在鼻咽癌中過(guò)表達(dá)且具有重要的臨床意義，HAX-1過(guò)表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移。Wang等[15]報(bào)道表明HAX-1表達(dá)量在甲狀腺癌中也升高，而干擾其表達(dá)可有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前為止，還沒(méi)有HAX-1在OSCC發(fā)展中作用的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，HAX-1在OSCC組織中表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾HAX-1表達(dá)后，OSCC細(xì)胞的活力、增殖和侵襲能力均顯著降低，該結(jié)果與以上文獻(xiàn)中HAX-1在鼻咽癌和甲狀腺癌中的作用一致。細(xì)胞活力是活細(xì)胞的數(shù)量的反應(yīng)，細(xì)胞增殖是細(xì)胞通過(guò)分裂而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自我更新和繁殖的重要生理過(guò)程，兩者均可以反映細(xì)胞的增殖能力。干擾HAX-1表達(dá)后，OSCC細(xì)胞的活力和增殖能力顯著降低，表明HAX-1沉默可以抑制OSCC細(xì)胞增殖能力。另一方面，干擾HAX-1表達(dá)后，OSCC細(xì)胞侵襲能力的降低表明HAX-1沉默可以抑制OSCC細(xì)胞向鄰近宿主組織侵犯。上述結(jié)果表明HAX-1沉默可抑制OSCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。多個(gè)研究指出HAX-1過(guò)表達(dá)與癌癥病理分期及預(yù)后差相關(guān)[16-17]，而HAX-1是否可以作為OSCC預(yù)后的標(biāo)志物有待進(jìn)一步研究。

原癌基因C-myc屬于myc基因家族，是具有多重功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的調(diào)控[18-19]。Tsai等報(bào)道表明c-myc可通過(guò)調(diào)節(jié)長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19 來(lái)調(diào)控非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞的增殖能力[20]。Hu等[21]發(fā)現(xiàn)c-myc參與Lanatoside C 調(diào)控的胃癌細(xì)胞的凋亡和增殖過(guò)程。另外，干擾c-myc可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[18]。有文獻(xiàn)表明，HAX-1可在內(nèi)皮祖細(xì)胞中調(diào)節(jié)AKT活性，且AKT可調(diào)節(jié)食管鱗狀細(xì)胞癌中調(diào)控c-myc表達(dá)[22-23]。AKT又稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，在細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中具有重要角色[24]。因此，我們假設(shè)在OSCC中HAX-1可通過(guò)調(diào)控AKT磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)c-myc表達(dá)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞增殖和侵襲能力。本研究中，干擾OSCC細(xì)胞HAX-1顯著降低AKT磷酸化水平和c-myc蛋白表達(dá)量。AKT激動(dòng)劑SC79(1.5 和2 μg/mL)分別孵育干擾了HAX-1的OSCC細(xì)胞24 h，有效提高了AKT磷酸化水平和c-myc蛋白表達(dá)量，表明AKT的活化可阻礙OSCC細(xì)胞中HAX-1干擾對(duì)c-myc蛋白表達(dá)量的作用。揭示在OSCC細(xì)胞中HAX-1可通過(guò)AKT調(diào)控c-myc表達(dá)。另外，干擾HAX-1的同時(shí)過(guò)表達(dá)c-myc，可明顯阻礙HAX-1干擾對(duì)OSCC 細(xì)胞活力、增殖和侵襲能力的影響。因此，HAX-1可通過(guò)AKT調(diào)節(jié)c-myc的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲的能力，這可能是HAX-1沉默抑制OSCC細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。

本研究存在一些不足：樣本量過(guò)小，結(jié)論有待繼續(xù)研究，后期實(shí)驗(yàn)需要收集更多的樣本用以驗(yàn)證HAX-1的表達(dá)及其與預(yù)后可能的關(guān)系。同時(shí)，后期擬通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HAX-1在OSCC中的作用機(jī)制。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OSCC細(xì)胞中HAX-1蛋白表達(dá)量上調(diào)，且干擾HAX-1顯著降低OSCC細(xì)胞活力、增殖和侵襲能力。干擾HAX-1還可以通過(guò)調(diào)控AKT/c-myc信號(hào)通路來(lái)降低OSCC細(xì)胞增殖和侵襲能力。因此，HAX-1有可能作為治療OSCC的靶標(biāo)分子。