王明杰， 張學(xué)軍

天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院檢驗(yàn)科 (天津 300140)

肝硬化常見于長期的慢性肝炎患者，細(xì)菌感染是其常見的并發(fā)癥之一。并發(fā)感染由多方面因素所致，如門脈高壓導(dǎo)致的上消化道出血繼發(fā)感染，患者腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致腸道通透性的改變等[1-2]。肝硬化合并感染患者的治療較為復(fù)雜，由于患者機(jī)體抵抗力差，一旦感染，對(duì)感染病情控制難度更大，普遍預(yù)后不良[3]。目前，關(guān)于肝硬化并發(fā)感染患者的發(fā)病原因及其相關(guān)影響因素的研究較少，而Toll樣受體2 (toll-like receptors 2，TLR2) 、Toll樣受體4 (toll-like receptors 4，TLR4)及白細(xì)胞分化抗原14 (cluster of differentiation 14，CD14)是經(jīng)典的內(nèi)毒素識(shí)別受體，與機(jī)體感染后單核-巨噬系統(tǒng)的激活有密切關(guān)系，而后者在肝臟的損傷機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[4-5]。白細(xì)胞分化抗原64 (cluster of differentiation 64，CD64)及白細(xì)胞分化抗原163 (cluster of differentiation 163，CD163)是已知的反映單核細(xì)胞活化的指標(biāo)，其升高提示著機(jī)體單核細(xì)胞的活化。白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)在機(jī)體控制免疫及炎癥反應(yīng)中有著重要作用，是體內(nèi)重要的促炎因子，在炎癥發(fā)生的時(shí)候，體內(nèi)的分泌會(huì)有明顯上升。而腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-8 (interleukin-8，IL-8)、白細(xì)胞介素-10 (interleukin-10，IL-10)與機(jī)體的炎癥狀態(tài)及單核細(xì)胞的功能發(fā)揮及激活有著密切的聯(lián)系[6]。本研究通過比較肝硬化并發(fā)感染患者與非感染患者的炎癥狀態(tài)，肝損傷程度及外周血中單核細(xì)胞的相關(guān)活性分子的表達(dá)水平，判斷感染因素在肝硬化病程中對(duì)損傷程度的影響，確定單核細(xì)胞在其中發(fā)揮重要的作用，及這些指標(biāo)的檢測在并發(fā)感染的肝硬化患者的篩查和診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1—12月本院收治患者，其中肝硬化感染組患者16例，肝硬化非感染組患者23例，普通感染組(排除肝臟相關(guān)疾病)患者24例，健康對(duì)照組32例。所有病例均經(jīng)血常規(guī)、肝功能及腹部B型超聲檢查，部分有腹部CT掃描結(jié)果。肝硬化診斷均符合2013年歐洲肝病學(xué)會(huì)指南中所制定的肝硬化并發(fā)細(xì)菌感染相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

細(xì)菌感染診斷包括：(1)血液或體液培養(yǎng)結(jié)果為陽性；(2)出現(xiàn)明確的感染癥狀、體征；(3)體溫升高或(和)白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高；(4)X線與超聲檢查顯示存在陽性病灶。

符合上述任意2項(xiàng)及2項(xiàng)以上均可確診為細(xì)菌感染。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 5810R新臺(tái)式離心機(jī)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；LightCycler? 96 Real-time PCR儀為瑞士羅氏公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生化分析儀7600-020為日本日立公司產(chǎn)品；全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀XE-2100為日本Sysmex公司產(chǎn)品；全自動(dòng)血凝儀為法國Stago公司產(chǎn)品。

1.2.2 主要試劑 Ficoll-Paque PLUS密度梯度離心液購于美國GE公司；RNA提取用TRIzol購于美國Ebioscience公司；RT PCR試劑盒購于美國Promega公司；Real-time PCR試劑盒購于瑞士羅氏公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 血液樣本采集 健康對(duì)照組采用健康人體檢標(biāo)本，為早晨空腹上肢靜脈血。感染及肝硬化患者均為住院患者晨起空腹抽取上肢靜脈血。血液抽取2份，一份分離血清，于-20℃凍存，一份抗凝血立刻行Ficoll密度梯度離心，提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞，將提取的單個(gè)核細(xì)胞離心沉淀后，立刻加入TRIzol試劑，于-80℃凍存。

1.3.2 RNA提取 單個(gè)核細(xì)胞中加入1 mL TRIzol，用槍反復(fù)混勻，室溫靜置5 min，使組蛋白充分降解，離心去除雜質(zhì)，轉(zhuǎn)移到新EP管中；加入0.2 mL氯仿，旋渦振蕩15 s，充分混勻后，靜置3 min，12 000g，4℃，15 min離心；離心后，組分分為3層，分別是底層紅色有機(jī)層，中間白色DNA層及頂層透明RNA層，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；使用異丙醇使RNA從水相中沉淀，以0.5 mL/1 mL TRIzol的量加入異丙醇，室溫靜置10 min，12 000g，4℃，10 min離心，可見沉淀于管底的膠樣RNA，吸去上清液；以1 mL/1 mL TRIzol加入70%乙醇，勿重懸，8 000g，4℃，5 min，重復(fù)洗滌2次，移去所有乙醇；干燥10 min，加入20 μL無酶水，58℃，10 min金屬浴助溶之后放置于冰上，使用凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，用分光光度計(jì)檢測RNA濃度，并繼續(xù)隨后實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄 按照試劑盒說明書進(jìn)行，cDNA逆轉(zhuǎn)完成后，分裝于-20℃保存。

1.3.4 Real-time PCR 體系總體積20 μL，包括9 μL cDNA模板，1 μL的引物及10 μL的SYBR Green MIX，于冰浴中配好反應(yīng)體系后，于Real-time PCR儀中運(yùn)行以下程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次。GAPDH作為內(nèi)參，檢測TLR2、TLR4、CD14等的表達(dá)，引物序列如下：GAPDH上游：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′ 下游：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′；TLR2上游：5′-AAGCAGCATATTTTACTGCTGG-3′下游：5′-CCTGAAACAAACTTTCATCGGT-3′；TLR4上游：5′-GACTGGGTAAGGAATGAGCTAG-3′ 下游：5′-ACCTTTCGGCTTTTATGGAAAC-3′；CD14上游：5′-GAACTCCCTCAATCTGTCGTTC-3′ 下游：5′-GTCCAGTGTCAGGTTATCCAC-3′；IL-1β上游：5′-GCCAGTGAAATGATGGCTTATT-3′ 下游：5′-AGGAGCACTTCATCTGTTTAGG-3′；CD64上游：5′-AGCTGTGAAACAAAGTTGCTCT-3′ 下游：5′-GGTCTTGCTGCCCATGTAGA-3′；CD163上游：5′-GCTGTGGTAACTTGCATCCTG-3′ 下游：5′-GCAGTAGTGTTCCACCCATCA-3′；TNF-α上游：5′-AAGCACACTGGTTTCCACACT-3′ 下游：5′-TGGGTCCCTGCATATCCGTT-3′；IL-6上游：5′-GAAGAGCGCCGCTGAGAAT-3′ 下游：5′-GTGCAGAGGGTTTAATGTCAACT-3′；IL-8上游：5′-CAAGGCTGGTCCATGCTCC-3′ 下游：5′-TGCTATCACTTCCTTTCTGTTGC-3′；IL-10上游：5′-GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTG-3′ 下游：5′-TCACATGCGCCTTGATGTCTG-3′。

2 結(jié)果

2.1 納入患者的臨床特征 四組患者的相關(guān)臨床特征見表1，四組患者的年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，健康對(duì)照組和普通感染組基本沒有肝硬化的相關(guān)并發(fā)癥，而肝硬化非感染組和肝硬化感染組出現(xiàn)肝硬化相關(guān)并發(fā)癥比例明顯增多。

表1 各組研究對(duì)象的相關(guān)臨床特征比較 例(%)

2.2 四組患者的檢驗(yàn)結(jié)果比較 普通感染組患者相較健康對(duì)照組，檢驗(yàn)結(jié)果提示炎癥指標(biāo)明顯上升，但是肝損指標(biāo)并無明顯區(qū)別；肝硬化感染組及肝硬化非感染組相較普通感染組，肝損指標(biāo)明顯上升，且肝硬化感染組的肝損指標(biāo)相較肝硬化非感染組上升顯著，見表2。

表2 收入的健康人及三組患者的血液結(jié)果分析

2.3 外周血單核細(xì)胞活化相關(guān)表面分子及其分泌炎癥因子的表達(dá)比較 肝硬化感染組相較肝硬化非感染組，單核細(xì)胞活化相關(guān)表面分子TLR2、TLR4、CD14、CD64表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CD163的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肝硬化感染組相較肝硬化非感染組，單核細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IL-8的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、2。

注：HCP:肝硬化非感染組；HCPI:肝硬化感染組；*、**分別表示P<0.05、P<0.001

注：HCP:肝硬化非感染組；HCPI:肝硬化感染組；*、**、***、****分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1

3 討論

肝硬化的病因多樣，通常是進(jìn)行性的炎癥及纖維化病變積累而造成，病理學(xué)表現(xiàn)為彌漫性肝纖維化及結(jié)節(jié)形成，患者常出現(xiàn)門脈高壓、腹腔積液、肝性腦病及消化道出血等并發(fā)癥[7-8]。此外，肝硬化患者的血竇微循環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂導(dǎo)致的門脈壓力增高，使腸道淤血[9]，改變了腸壁的通透性，使細(xì)菌更容易通過腸壁侵入人體循環(huán)系統(tǒng)，并遷移到身體其他部位，且肝硬化患者的診治過程中所有的侵入性操作也增加了患者感染的風(fēng)險(xiǎn)[10]。

據(jù)報(bào)道，肝硬化患者的醫(yī)院感染發(fā)生率可高達(dá)32%～34%[11]，主要包括肺部、腹腔及泌尿系統(tǒng)感染等[8]，肝硬化患者并發(fā)感染后，將加速肝硬化疾病的進(jìn)程，是肝硬化患者重要的死亡原因[12]。

Liu等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，這種并發(fā)細(xì)菌感染后導(dǎo)致肝硬化患者肝損傷加重的機(jī)制可能是患者在肝硬化的基礎(chǔ)上并發(fā)細(xì)菌感染后，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活，使炎性細(xì)胞如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等活化，并分泌炎性細(xì)胞因子，而激活的炎性細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子在遷移到損傷的組織時(shí)，導(dǎo)致了肝臟的進(jìn)一步損傷[14-15]。但本研究結(jié)果還提示，在正常的炎癥患者的肝臟中，沒有基礎(chǔ)損傷的狀況下，相對(duì)正常人卻沒有發(fā)現(xiàn)類似的肝損傷更嚴(yán)重的現(xiàn)象，故可以推測，機(jī)體炎癥狀態(tài)下的炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子只有在肝臟具有基礎(chǔ)損傷的狀態(tài)時(shí)，才會(huì)進(jìn)一步加重肝損傷的狀態(tài)。這說明，肝臟損傷后，損傷部位的微環(huán)境與遷移過去的細(xì)菌、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子復(fù)合作用后，導(dǎo)致了肝臟已損傷部位的進(jìn)一步損傷，而健康人的健康肝臟所處的微環(huán)境并不支持這個(gè)過程的發(fā)生[16-17]。

TLR2、TLR4、CD14、IL-1β都是在細(xì)菌感染后，固有免疫系統(tǒng)激活過程中的關(guān)鍵作用分子[18]；CD64及CD163與單核-巨噬系統(tǒng)的激活的活化相關(guān)[19]；而TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10[20]在機(jī)體的感染、炎癥進(jìn)程及單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化中均發(fā)揮著重要的作用。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)表明，單核-巨噬系統(tǒng)的活化及極化在肝臟的炎癥損傷及纖維修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[5]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，肝硬化感染組相較肝硬化非感染組，TLR2、TLR4、CD14、CD64這4個(gè)指標(biāo)在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)水平都出現(xiàn)了較為明顯的上升，且相關(guān)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的表達(dá)也上升顯著。與此同時(shí)，肝硬化感染組的外周血TBIL、ALB等反映肝損傷程度的指標(biāo)也普遍高于肝硬化非感染組。證明了單核細(xì)胞活化相關(guān)的表面分子TLR2、TLR4、CD14、CD64，及炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的表達(dá)水平與肝硬化患者并發(fā)感染后肝損傷程度的相關(guān)性。同時(shí)提示了這些指標(biāo)在判斷肝硬化患者的細(xì)菌感染情況及身體的炎癥嚴(yán)重程度方面有望發(fā)揮更重要的作用，也提示了肝硬化患者在并發(fā)感染后，肝損傷程度加重的機(jī)制及相關(guān)影響因素。

并發(fā)感染的肝硬化患者相對(duì)非感染患者，肝損傷程度加重，單核細(xì)胞的相關(guān)活性分子的表達(dá)水平與感染狀態(tài)及肝損傷程度密切相關(guān)，說明單核細(xì)胞的相關(guān)活性分子的分泌與并發(fā)感染肝硬化患者疾病加重聯(lián)系密切，且相關(guān)指標(biāo)的檢測在肝硬化患者并發(fā)感染的篩查及診斷預(yù)后中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。