陳國權(quán)，王 娜，張 旭，趙大杰，閻朝華，周碧君，3*，王開功，3，程振濤，3，文 明，3*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025； 2. 貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州貴陽550025；3. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025)

鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis)屬于巴氏桿菌科，雞桿菌屬，是1種定殖于禽類上呼吸道和下生殖道的條件致病菌[1，2]。主要感染雞、鴨、鵝、火雞等，輸卵管是其主要靶器官，常引起腹膜炎、輸卵管炎、卵巢炎、輸卵管囊腫等疾病，導(dǎo)致開產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降，死亡率上升，是影響?zhàn)B禽業(yè)的1種重要病原菌，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2，3]。2019年11月初，貴州省六盤水市鐘山區(qū)某蛋雞養(yǎng)殖場的開產(chǎn)蛋雞(品種為烏蒙鳳雞)表現(xiàn)腹膜炎和輸卵管炎癥狀，產(chǎn)蛋率下降，疑似鴨源雞桿菌感染。為確診發(fā)病原因，本試驗(yàn)通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、16S rRNA基因鑒定及序列分析進(jìn)行診斷，并通過藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥，為貴州省鴨源雞桿菌病的臨床診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測病料選取臨床發(fā)病的130日齡開產(chǎn)蛋雞6只，無菌采集心臟、肝臟、脾臟組織作為檢測病料。

1.2 主要試劑2×TaqPCR MasterMix[購于天根生化科技(北京)有限公司]，DL 2 000 DNA Marker[購于寶生物工程(大連)有限公司]，Gel Extration Kit膠回收試劑盒(購于Omega公司)，革蘭氏染色液(購于北京索萊寶科技有限公司)，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、微量生化鑒定管、藥敏紙片(購于杭州微生物試劑有限公司)，新生牛血清(購于浙江天杭生物科技有限公司)，鮮血瓊脂培養(yǎng)基(貴州省動(dòng)物疫病研究室自制)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌接種病雞的心臟、肝臟、脾臟組織于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h，觀察菌落生長情況。無菌挑取單個(gè)呈β溶血的優(yōu)勢菌落分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，觀察純化后的菌落形態(tài)，并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體染色特性及形態(tài)。

1.4 細(xì)菌生化試驗(yàn)挑取分離菌純培養(yǎng)物無菌接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、過氧化氫酶、磷酸酶、氧化酶、靛基質(zhì)、尿素等20種微量生化鑒定管[4]，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》判定反應(yīng)結(jié)果。

1.5 細(xì)菌16S rRNA基因鑒定無菌挑取經(jīng)純化后的單個(gè)菌落于裝有ddH2O 50 μL的無菌離心管中，參照煮沸法提取細(xì)菌總DNA[5]。參照文獻(xiàn)方法合成細(xì)菌16S rRNA基因通用引物(27F：5’-AGAGT TTGATCATGGCTCAG-3’；1 492R：5’-TACGGTT ACCTTGTTACGACTT-3’。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為1 400 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6]。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳并使用膠回收試劑盒回收目的片段，送至華大基因科技有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取部分參考菌株的16S rRNA基因序列，應(yīng)用MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.6 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，挑取單個(gè)純培養(yǎng)菌落接種于含5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)16 h，然后吸取菌液100 μL均勻涂布于鮮血瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子夾取藥敏紙片緊貼于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，參考抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 菌落及菌體形態(tài)細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果顯示，在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長出表面光滑、半透明、有光澤、灰白色、直徑1～2 mm、呈β溶血的凸起小菌落(見圖1)。麥康凱培養(yǎng)基無菌落生長。分離菌經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)為兩端鈍圓、無芽孢、單個(gè)或成對(duì)排列的革蘭氏陰性短小桿菌(見圖2)。

2.2 細(xì)菌生化特性分離菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇；過氧化氫酶、磷酸酶、氧化酶、靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陽性；能分解尿素，不具運(yùn)動(dòng)性(見表1)。該分離菌生化特性與鴨源雞桿菌相符，命名為GZ-LPS2019。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為1 400 bp，經(jīng)純化后測序得到大小為1 383 bp片段，與預(yù)期結(jié)果基本相符(見圖3)。

2.4 細(xì)菌16S rRNA基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析分離菌GZ-LPS2019與8株鴨源雞桿菌參考菌株的16S rRNA基因同源性高達(dá)98.2%～99.6%；與同屬于雞桿菌屬的4株輸卵管炎雞桿菌和4株虎皮鸚鵡雞桿菌的16S rRNA基因同源性分別為87.3%～91.4%、87.4%～92.8%(見圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，分離菌株GZ-LPS2019與8株鴨源雞桿菌參考菌株聚為1支且與參考菌株GQ423347.1親緣關(guān)系最近，與4株輸卵管炎雞桿菌和4株虎皮鸚鵡雞桿菌參考菌株均處于不同的分支(見圖5)。結(jié)合分離菌的形態(tài)特征、生化特性及16S rRNA基因序列分析，確定分離菌為鴨源雞桿菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果由表2可見：分離菌對(duì)羧芐西林、氧氟沙星高度敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、多粘菌素B中度敏感；對(duì)復(fù)方新諾明、苯唑西林、丁胺卡那、頭孢拉定、四環(huán)素等11種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥。

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)檢測病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、16S rRNA基因鑒定及序列分析，綜合鑒定分離菌為鴨源雞桿菌，確診該蛋雞場烏蒙鳳雞發(fā)病原因?yàn)轼喸措u桿菌感染。

4 討論

4.1鴨源雞桿菌易引起120～140日齡開產(chǎn)蛋雞的輸卵管炎和腹膜炎，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降。該蛋雞場開產(chǎn)蛋雞的臨床病例特點(diǎn)與鴨源雞桿菌感染基本相符。

4.2家禽在飼養(yǎng)過程中如廣泛使用抗生素會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生多重耐藥菌株，對(duì)公共衛(wèi)生也構(gòu)成威脅。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌GZ-LPS2019對(duì)苯唑西林、青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素等11種抗菌藥物具有耐藥性，為多重耐藥菌株。方翟等[7]對(duì)湖北新洲地區(qū)鴨源雞桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)紅霉素、恩諾沙星、苯唑西林、卡那霉素、四環(huán)素等多種抗菌藥物具有耐藥性；Hess Claudia等[8]調(diào)查了213株鴨源雞桿菌的耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分離株對(duì)四環(huán)素、泰樂菌素、恩諾沙星等抗菌藥物具有耐藥性，且來源于蛋雞生殖道的分離菌株相比其他器官的分離株呈現(xiàn)出更明顯的耐藥性。這些研究結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。建議該場選用高度敏感藥物羧芐西林、氧氟沙星進(jìn)行有效治療；在養(yǎng)殖過程中應(yīng)嚴(yán)格控制抗菌藥物使用，根據(jù)藥物的休藥期合理安排用藥，同時(shí)在后續(xù)養(yǎng)殖過程中嚴(yán)禁盲目用藥、濫用抗生素。