宋雪梅，梁琪*，宋國(guó)順,張炎

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070)

高血壓現(xiàn)已成為全球性的主要健康風(fēng)險(xiǎn)，它能引起心腦血管疾病、心力衰竭和終末期腎臟病等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，因高血壓引發(fā)的心腦血管疾病至少占到了整個(gè)心腦血管疾病的50%[1]。血壓受不同生化途徑調(diào)控，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和舒血管素-激肽系統(tǒng)是其中的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)是這些血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，它能促進(jìn)血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，降解緩激肽為無(wú)活性片段，從而導(dǎo)致血壓升高。因此，通過(guò)抑制ACE活性，有助于降低機(jī)體血壓。然而，化學(xué)合成的ACE抑制劑對(duì)人體具有副作用。一些源自牛乳[2]、小麥[3]、肉[4]等的食源性多肽,因安全，易與ACE結(jié)合、反應(yīng)等特性，備受研究者關(guān)注。

干酪是重要的發(fā)酵乳制品，富含蛋白質(zhì)和復(fù)雜多樣的蛋白酶。成熟干酪中酪蛋白經(jīng)凝乳酶、微生物蛋白酶、肽酶等作用，逐級(jí)降解為多肽，這些多肽不僅參與干酪風(fēng)味、滋味和質(zhì)地等形成，而且部分多肽還具有生物活性。Cheddar[5]、Gouda[6]、Emmental等[7]干酪的水溶性提取物已發(fā)現(xiàn)具有ACE抑制作用。GMEZ-RUIZ等[8]從成熟8個(gè)月的綿羊乳Manchego干酪的水溶性提取物中分離、鑒定出ACE抑制肽。Cheddar干酪中鑒定的VPP和IPP,對(duì)小鼠和人類(lèi)具有降血壓作用[9]。

牦牛乳硬質(zhì)干酪富含蛋白質(zhì)，前期發(fā)現(xiàn)其水溶性提取物中含有生物活性多肽[10]。生物活性多肽經(jīng)胃腸液消化、吸收，達(dá)到心血管系統(tǒng)后，才能發(fā)揮作用。生物活性多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息與其生物活性密切相關(guān)，多肽的氨基酸組成和序列信息對(duì)其生物活性具有重要影響。因此，本試驗(yàn)使用胃蛋白酶和胰蛋白酶，模擬體外胃腸液消化，運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術(shù)，基于已報(bào)道的ACE抑制肽結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系，進(jìn)一步比較牦牛乳硬質(zhì)干酪經(jīng)消化酶降解前后ACE抑制肽差異，為開(kāi)發(fā)出具有功能特性的牦牛乳硬質(zhì)干酪提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

牦牛乳，甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)；CHOOZIT型乳酸菌發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)，丹麥丹尼斯克公司；小牛凝乳酶(酶活力10萬(wàn)U/g)，蘭州生物技術(shù)有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、甲酸(質(zhì)譜級(jí))，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胃蛋白酶(USP級(jí)，1∶30 000)、胰蛋白酶(生物試劑純，1∶250，250 U/mg，USP級(jí))， 上海源葉生物科技有限公司；乙腈(質(zhì)譜級(jí))，美國(guó)Fisher Chemical公司。

1.2 儀器與設(shè)備

自制干酪槽；真空包裝機(jī),廣東中山市名康包裝機(jī)械廠(chǎng)；TGL-20 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Scientz-10ND真空冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；723紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司；Ultimate 3000毛細(xì)管高效液相色譜儀、Quadrupole-Orbitrap質(zhì)譜儀,美國(guó)Thermo Fishier Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干酪制作

參考劉興龍等[11]的方法，適當(dāng)微調(diào)，具體工藝流程如下：

原料乳→檢驗(yàn)→巴氏殺菌(60 ℃、30 min)→冷卻至32 ℃→添加發(fā)酵劑(10 g/L原料乳)→添加CaCl2(0.3 g/L原料乳)→添加凝乳酶→凝乳(40 min)→切割→排乳清→二次加熱(溫度緩慢從35 ℃升到45 ℃)→排乳清→攪拌、加鹽(20 g/kg凝乳塊)→堆釀→壓榨成型→真空包裝→15 ℃下成熟6個(gè)月該成熟牦牛乳硬質(zhì)干酪水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.8%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.22%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.9%。最后，將貯藏于-18 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 干酪水溶性多肽的提取

參考RIZZELLO等[12]的方法提取。以1∶3(g∶mL)加入磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)，150 r/min，40 ℃恒溫振蕩1 h后，4 ℃、4 200 r/min離心30 min，除去上層脂肪后，用Whatman No.2濾紙真空過(guò)濾，將濾液pH值調(diào)至4.6，4 ℃、7 500 r/min離心10 min，即獲得上清液。真空冷凍干燥，于-18 ℃儲(chǔ)藏備用。

1.3.3 干酪水溶性多肽的體外消化

參考LO等[13]的方法進(jìn)行體外試驗(yàn)。配制30 g/L的干酪水溶性多肽溶液10 mL，用1 mol/L鹽酸將pH調(diào)節(jié)為2.0，加入適量胃蛋白酶，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，搖動(dòng)、恒溫(37 ℃)反應(yīng)2 h，沸水浴5 min。使用0.9 mol/L NaHCO3將溶液pH調(diào)節(jié)為5.0，再用1 mol/L NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)為7.5，加入適量胰蛋白酶， 使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，搖動(dòng)、恒溫(37 ℃) 反應(yīng)2 h，沸水浴滅酶5 min，最后，取上清液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4 ACE抑制活性測(cè)定

參考CUSHMAN等[14]的方法，采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。5 mmol/L的HHL溶液與40 μL ACE 抑制肽混合(緩沖溶液作為空白樣品)，37 ℃水浴預(yù)熱53 min后，加入0.1 U/mL ACE溶液20 μL，繼續(xù)37 ℃水浴反應(yīng)30 min。隨后加入1 mol/L HCl溶液100 μL終止反應(yīng)。將各試劑依次加入5 mL離心管中并混勻，待反應(yīng)結(jié)束后，加入1.7 mL乙酸乙酯萃取馬尿酸，經(jīng)15 s振蕩、混勻后離心(4 000 r/min，15 min，4 ℃)，吸取1.0 mL乙酸乙酯層于小試管中，放在100 ℃水浴鍋中15 min，之后加入3 mL去離子水于試管中，228 nm處測(cè)定吸光度，按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A,反應(yīng)中ACE抑制肽與ACE同時(shí)存在的吸光度值；B,反應(yīng)中沒(méi)有ACE抑制肽的吸光度值；C,反應(yīng)中ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度值。

1.3.5 采用LC-MS/MS進(jìn)行多肽分析

色譜條件：Acclaim PepMap Rplc C18(1.9 μm×150 μm×150 mm)色譜柱；流動(dòng)相A 0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸，2%乙腈；流動(dòng)相B 0.1%甲酸，80%乙腈。梯度洗脫程序：0～8 min(6%～9%流動(dòng)相B)；8～24 min(9%～14%流動(dòng)相B)；24～60 min(14%～30%流動(dòng)相B)；60～75 min(30%～40%流動(dòng)相B)；75～78 min(40%～95%流動(dòng)相B)；流速600 nL/min。

質(zhì)譜條件：一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)分辨率70 000；AGC目標(biāo)3e6；一級(jí)最大注射時(shí)間40 ms；掃描范圍m/z300～1 600；二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)分辨率75 000；AGC目標(biāo)1e5；一級(jí)最大注射時(shí)間60 ms。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS 19.0進(jìn)行作圖和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。如果方差分析差異顯著，用Duncan法進(jìn)行多重比較。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)采用Maxquant(1.6.2.10)檢索目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索參數(shù)為可變修飾為N段乙?；?N-acetyl)、甲硫氨酸氧化[Oxidation(M)]；半胱氨酸固定化修飾為氨基甲?；痆Carbamidomethyl (C)]；一級(jí)質(zhì)譜誤差為6 ppm；二級(jí)質(zhì)譜誤差為20 ppm；遺漏酶切位點(diǎn)為2；顯著性閾值為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳硬質(zhì)干酪水性多肽體外消化前后ACE抑制活性比較

牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶降解前后的ACE抑制活性比較見(jiàn)圖1。從圖1可知，干酪經(jīng)消化酶降解后，其ACE抑制率降低了13.06%，這說(shuō)明消化酶對(duì)干酪水溶性多肽的ACE抑制活性具有一定影響。但是與消化前干酪水溶性多肽ACE抑制活性間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這表明干酪水溶性多肽經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶作用后，其ACE抑制活性基本保持穩(wěn)定。

圖1 牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽體外消化前后ACE抑制活性比較Fig.1 Comparison of the ACE-inhibitory activity of water-soluble extract of hard cheese made from yak milk andin vitro digest

2.2 牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽體外消化前后質(zhì)譜分析

為了確定牦牛乳硬質(zhì)干酪體外消化前后，對(duì)ACE起抑制作用的多肽，本試驗(yàn)采用毛細(xì)管液相色譜結(jié)合Quadrupole-Orbitrap質(zhì)譜儀對(duì)干酪中水溶性多肽和消化酶降解物進(jìn)行了分離、鑒定(總離子流色譜原圖見(jiàn)增強(qiáng)出版)。

牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽和其消化酶降解物較為復(fù)雜。通過(guò)Maxiquant 軟件對(duì)所得質(zhì)譜圖與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，肽段分?jǐn)?shù)越高，肽段豐度越強(qiáng)，所得肽段越可靠。因此，依據(jù)多肽分值和豐度，鑒定出消化前后牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽分別為36和23種，具體結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

從表1可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪中源自аs1-酪蛋白、аs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的多肽分別為8、2、25和1種，源自аs1-酪蛋白和β-酪蛋白的多肽占總肽數(shù)量的91.67%。多肽氨基酸殘基數(shù)為7～25個(gè)，其中氨基酸殘基數(shù)為7～13個(gè)的多肽占總肽數(shù)量的41.67%。另外，發(fā)現(xiàn)一些多肽如KEDVPSERYL、KEDVPSERYLG、KEDVPSERYLGY等[23]之間存在相互關(guān)系，這主要與干酪中作用于蛋白質(zhì)的多樣和復(fù)雜的蛋白質(zhì)降解酶有關(guān)。

從表2可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪中源自аs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的多肽分別為4、18和1種，其中，源自аs1-酪蛋白和β-酪蛋白的多肽占總肽數(shù)量的95.65%。多肽氨基酸殘基數(shù)為7～14個(gè)，氨基酸殘基數(shù)為7～13個(gè)的多肽占總肽數(shù)量的95.83%。牦牛乳硬質(zhì)干酪經(jīng)消化酶作用后，其水溶性多肽中長(zhǎng)鏈肽減少，短鏈肽增多。

表1 牦牛乳硬質(zhì)干酪中水溶性多肽Table 1 Water-soluble peptides of hard cheese made from yak milk

表2 牦牛乳硬質(zhì)干酪體外消化后水溶性多肽Table 2 Water-soluble peptides of hard cheese made from yak milk after in vitro digestion

續(xù)表2

ACE抑制肽是ACE的競(jìng)爭(zhēng)性底物，其多肽結(jié)構(gòu)和ACE活性相互關(guān)系顯示，其C-末端含有疏水性氨基酸殘基時(shí)，更傾向與ACE的催化位點(diǎn)結(jié)合。結(jié)合表1和表2，干酪中25種多肽C-末端含有疏水性氨基酸如脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸如色氨酸(Trp)等。干酪消化后14種多肽C-末端含有疏水性氨基酸如Leu、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和堿性氨基酸如賴(lài)氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。更為重要的是，干酪消化前后與已報(bào)道的ACE抑制肽具有一定同源性的多肽分別為29和13種，分別占總肽數(shù)量的80.56%和56.52%，這說(shuō)明牦牛乳硬質(zhì)干酪的水溶性多肽和消化酶降解物中存在較多ACE抑制肽。ACE抑制肽C-末端三肽的氨基酸組成對(duì)抑制ACE活性影響最大[16]，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，消化前后牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽C-末端三肽的序列與已確定ACE抑制肽相同的分別占總肽數(shù)量的36.11%和30.43%，這些多肽有助于消化前后干酪對(duì)ACE的抑制作用。

2.3 牦牛乳硬質(zhì)干酪體外消化前后ACE抑制肽質(zhì)譜分析

依據(jù)ACE抑制肽C-末端特征、肽鏈長(zhǎng)度以及文獻(xiàn)所報(bào)道的ACE抑制肽，牦牛乳硬質(zhì)干酪體外消化前后共鑒定出ACE抑制肽分別為15、12種，詳細(xì)ACE抑制肽序列和特征見(jiàn)表3。

從表3可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪體外消化前后ACE抑制肽主要源自β-酪蛋白，相同ACE抑制肽3種，大多數(shù)ACE抑制肽由8～12個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量在800～1 500 Da。ACE抑制肽一般含有2～12個(gè)氨基酸殘基[26]，因此，大多數(shù)ACE抑制肽鏈長(zhǎng)度在此范圍內(nèi)。多肽C-末端三肽氨基酸分別為疏水性氨基酸如酪氨酸(Tyr)、Phe、Trp、丙氨酸(Ala)、Ile、Leu、Val和 Met或者帶正電的氨基酸如Arg、Lys以及Pro時(shí)，該肽能很好地與ACE結(jié)合[27]，如干酪消化前后的PVLGPVRGPFP、TDVENLHLPLPL、TDVENLHLPLPLL、VENLHLPLPLL、KEDVPSERYL、QEPVLGPVRGPFP、VLGPVRGPFPIIV、PVLGPVRGPFPIIV、YQEPVLGPVRGPFPI、YQEPVLGPVR等的C-末端三肽氨基酸具有以上特征。源自牦牛乳酪蛋白降解物L(fēng)PLPLL具有ACE抑制活性,其半抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)為10.46 μmol/L[19]，而TDVENLHLPLPLL、VENLHLPLPLL的C-端共享了此部分序列。

ACE抑制肽的C-端氨基酸組成對(duì)其發(fā)揮ACE抑制作用具有重要影響。消化前牦牛乳硬質(zhì)干酪中源自β-酪蛋白的PVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFP、QEPVLGPVRGPFP和KEDVPSERYLGY的C-末端為Pro或Tyr，該結(jié)構(gòu)易于和ACE結(jié)合。干酪中KEDVPSERYL、KEDVPSERYLG、KKYKVPQL與已報(bào)道ACE抑制肽VPSERYL、KKYNVPQL(IC50為77.1 μmol/L)[9]存在相同片段。牦牛乳硬質(zhì)干酪中VLGPVRGPFPIIV、PVLGPVRGPFPIIV與Cheddar干酪中ACE抑制肽YQEPVLGPVRGPFPIIV[5]以及干酪中SQSKVLPVPQ與SKVLPVPQ在多肽C-末端具有高度相似性，而SKVLPVPQ(IC50為39 μmol/L)已證實(shí)具有較強(qiáng)ACE抑制活性[17]。干酪中YQEPVLGPVRGPFPI和QEPVLGPVRGPFP已報(bào)道具有ACE抑制活性[6,9,28]。

表3 牦牛乳硬質(zhì)干酪中體外消化前后ACE抑制肽Table 3 ACE-inhibitory peptides from hard cheese made from yak milk before and after simulatedgastro-intestinal digestion.

牦牛乳硬質(zhì)干酪消化后的LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN是非常具有潛力的 ACE抑制肽，它們的抑制活性已分別在山羊乳Kefir[29]及源自β-酪蛋白消化酶產(chǎn)物中被證實(shí)[30]。Gouda干酪中發(fā)現(xiàn)的YPFPGPIPN[6]和源自牦牛乳酪蛋白的PFPGPIPN對(duì)ACE的IC50分別14.8和12.79 μmol/L[19]，且YPFPGPIPN對(duì)隨機(jī)高血壓鼠具有降壓作用[6]，因此，消化后牦牛乳硬質(zhì)干酪中的LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN具有較強(qiáng)ACE抑制作用。多肽C-末端含有賴(lài)氨酸(K)時(shí)[31]，該肽也具有抑制作用，如干酪消化后的源自β-酪蛋白的KVLPVPQK。干酪消化后的VVPPFLQPEVM、PVVVPPFLQPEVM與源自酸奶的PPFLQPEVM(IC50為34.63 μmol/L)[25]共享了C-端氨基酸序列。另外，多肽N-端為脂肪族氨基酸如Ala、Val、Leu和Ile時(shí)，能有效與ACE結(jié)合[32]。因此，這些肽具有潛在A(yíng)CE抑制活性。消化后牦牛乳硬質(zhì)干酪中KVLPVPQK與發(fā)酵乳中ACE抑制肽KVLPVPQ、VLPVPQK高度共享了部分序列[20]。消化后干酪中YQEPVLGPVR已證實(shí)具有ACE抑制活性[24]。

綜上所述，牦牛乳硬質(zhì)干酪消化前后鑒定的大多數(shù)ACE抑制肽具備了抑制ACE活性的結(jié)構(gòu)特征，干酪消化前后分別有10和8種ACE抑制肽與已報(bào)道ACE抑制肽共享了C-末端三肽氨基酸特征，干酪中SKVLPVPQ、QEPVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFPI和干酪消化后LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN、YQEPVLGPVR已確定具有ACE抑制活性。

3 討論

成熟短期到中長(zhǎng)期干酪中水溶性提取物具有較強(qiáng)ACE抑制作用[33]，但是干酪水溶性提取物中ACE-I抑制肽經(jīng)胃腸蛋白質(zhì)酶降解后[7]，其潛在作用將發(fā)生變化。為此，結(jié)合前期試驗(yàn)，本試驗(yàn)以15 ℃成熟6個(gè)月的牦牛乳硬質(zhì)干酪中水溶性多肽為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)牦牛乳硬質(zhì)干酪中1種ACE抑制肽源自аs1-酪蛋白，13種源自β-酪蛋白，1種源自аs2-酪蛋白，經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后，11種ACE抑制肽源自β-酪蛋白，1種源自κ-酪蛋白。GOMEZ-RUIZ等[34]利用高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)在不同西班牙干酪中鑒定出ACE抑制肽41種，且大部分來(lái)自β-酪蛋白和аs1-酪蛋白。酪蛋白含有豐富的脯氨酸，乳酸菌擁有特異性脯氨酸肽酶，因此，干酪中ACE抑制肽主要來(lái)源于β-酪蛋白和аs1-酪蛋白[33]。

牦牛乳硬質(zhì)干酪中ACE抑制肽為其具有ACE抑制活性提供了可能。但是，不同ACE抑制肽在胃腸液中的存在能力不同[9]。胃蛋白酶特異性較低，主要水解多肽氨基端或羧基端為芳香族氨基酸或者疏水性氨基酸，而胰蛋白酶特異性酶切位點(diǎn)主要傾向于堿性氨基酸如Arg或者Lys。干酪中YQEPVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFPI、YQEPVLGPVRGPFPII經(jīng)消化酶作用后，轉(zhuǎn)化為YQEPVLGPVR。干酪中KVLPVPQKAVPYPQ、SKVLPVPQKAVPYPQ、SKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQ、SQSKVLPVPQKAVPYPQ、SQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQ等轉(zhuǎn)化為KVLPVPQK，這說(shuō)明牦牛乳硬質(zhì)干酪中ACE抑制肽，甚至活性較弱或者沒(méi)有活性的多肽經(jīng)胃胰蛋白酶消化后能夠轉(zhuǎn)化為其他ACE抑制肽。B.bifidumMF 20/5發(fā)酵乳中LVYPFP經(jīng)胃蛋白酶水解后，也產(chǎn)生了具有更強(qiáng)ACE抑制活性的多肽[35]。

牦牛硬質(zhì)干酪中ACE抑制肽15種，經(jīng)消化酶降解后，干酪中ACE抑制肽變?yōu)?2種，且大多數(shù)ACE抑制肽種類(lèi)不同。這說(shuō)明，消化酶對(duì)干酪中ACE抑制肽種類(lèi)有影響。STUKNYTE等對(duì)比了不同干酪中的8種ACE抑制肽，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)體外胃腸消化后，Cheddar、Gorgonzola、Maasdam、Grana Padano等干酪中只存在VPP、IPP、HLPLP、LHLPLP等4種ACE抑制肽[36]。Emmental 干酪中具有ACE-I活性的多肽經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白水解后，ACE抑制活性分別降低了(33±13)%和(32±13)%[7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牦牛乳硬質(zhì)干酪經(jīng)體外消化后其ACE抑制活性與消化前無(wú)顯著性差異。一方面，可能與牦牛乳硬質(zhì)干酪消化后活性較強(qiáng)ACE抑制肽的生成量有關(guān)；另一方面，也可能存在干酪消化后ACE抑制肽的協(xié)同效應(yīng)，因此，還需要進(jìn)一步對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪消化前后ACE抑制活性強(qiáng)的多肽進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

牦牛乳硬質(zhì)干酪鑒定出ACE抑制肽15種，經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后，ACE抑制肽為12種。大多數(shù)ACE抑制肽源自β-酪蛋白，分子質(zhì)量為 800～1 500 Da。相同ACE抑制肽3種，大多數(shù)ACE抑制肽不同。通過(guò)詳細(xì)對(duì)ACE抑制肽氨基酸組成分析，發(fā)現(xiàn)干酪體外消化前后的大多數(shù)ACE抑制肽具備抑制ACE活性的結(jié)構(gòu)特征，干酪消化前后分別有10和8種ACE抑制肽與已報(bào)道ACE抑制肽共享了其C-末端的三肽氨基酸，它們是潛在A(yíng)CE抑制肽。其中，干酪中SKVLPVPQ、QEPVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFPI和干酪消化后LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN、YQEPVLGPVR確定具有ACE抑制活性。干酪水溶性多肽與其經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶降解的酶解物的ACE抑制活性間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這為開(kāi)發(fā)具有保健功能特性的牦牛乳硬質(zhì)干酪提供了理論依據(jù)。