張倩玉， 許 斌， 金 偉， 周守兵， 李文娟， 張秋君， 胡丹丹， 李文玉， 劉 虎

(1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 西區(qū)腫瘤科(安徽省腫瘤醫(yī)院)， 合肥 230000； 2. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院 腫瘤一科， 武漢 430060)

惡性腫瘤是我國(guó)發(fā)病率及死亡率最高的疾病之一，放射治療作為一種常見(jiàn)的治療方式常被用于癌癥的局部治療。約有50%～60%的癌癥患者接收放射治療[1]。然而，會(huì)有95%的放療患者會(huì)在放療期間或放療結(jié)束之后出現(xiàn)急性放射性皮炎[2]。急性放射性皮炎是一種常見(jiàn)的放療并發(fā)癥，定義為一種由β,γ或X射線(xiàn)所造成的一系列皮膚副反應(yīng)，通常發(fā)生于放療后90 d之內(nèi)[3]，臨床表現(xiàn)為不適感、灼燒感、瘙癢、疼痛等[4]，嚴(yán)重者會(huì)影響抗腫瘤治療的順利進(jìn)行。因此，越來(lái)越多的研究著眼于探討其發(fā)病機(jī)制及防治措施。目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)方法治療或預(yù)防急性放射性皮炎的發(fā)生。

柚皮素(4′,5,7-三羥基二氫黃酮)是一種富含于柑橘、葡萄和番茄等水果中的黃酮類(lèi)化合物[5-6]，其已被證實(shí)具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[7-8]，但柚皮素對(duì)于癌癥局部治療所用放射性所導(dǎo)致的急性放射性皮炎有無(wú)作用暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究探討了柚皮素通過(guò)不同給藥方式對(duì)于接受放射線(xiàn)的SD大鼠是否具有保護(hù)作用。同時(shí)觀察了柚皮素對(duì)于在臨床中接受頭頸部放療的患者急性放射性皮炎的發(fā)生發(fā)展所起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來(lái)源 清潔級(jí)健康SD大鼠共40只，雄性，質(zhì)量240～260 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.2 患者一般資料 觀察因頭頸部惡性腫瘤行頸部放療或同步放化療，劑量≥30 Gy，患者11名，9名男性，2名女性，年齡26～73歲之間，其中7人診斷為鼻咽癌，3人診斷為喉癌，1人為鼻腔未分化癌?；颊唠p側(cè)頸部劑量一致，ECOG評(píng)分0～1分。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)平均分為5組，每組8只，分別為預(yù)防性使用外用柚皮素(照射前5 d開(kāi)始涂抹，每天2次)、治療性使用外用柚皮素(自發(fā)生肉眼可見(jiàn)的放射性皮炎后開(kāi)始涂抹柚皮素乳膏，每天2次)、照射后口服柚皮素組(自放療完成后第一天開(kāi)始灌胃，每天1次，200 mg/kg)、模型組(自發(fā)生肉眼可見(jiàn)的放射性皮炎后開(kāi)始使用溶劑乳膏，每天1次)、空白對(duì)照組，除對(duì)照組不接受放射外，其余各組大鼠均接受臀背部皮膚照射。照射前將所有動(dòng)物使用電動(dòng)推刀局部去毛。射線(xiàn)照射時(shí)采用異氟烷吸入方式麻醉。

1.2.2 動(dòng)物照射方法

射線(xiàn)類(lèi)型：6 MV電子線(xiàn)，45 Gy，照射野為3×3 cm，劑量率300 MU/min，使用1.5 cm補(bǔ)償膜覆蓋于動(dòng)物皮膚表面，單次照射源皮距為100 cm，每次照射1只。

對(duì)照組：局部去毛，麻醉，不照射。

1.2.3 患者試驗(yàn)方法

所有患者注意宣教自放療開(kāi)始保持局部皮膚清潔、干燥，避免摩擦及用力清潔等操作，自開(kāi)始出現(xiàn)I°放射性皮損后以頸部正中線(xiàn)為界限，隨機(jī)選取一側(cè)涂抹柚皮素乳膏，涂抹在放射野處(試驗(yàn)區(qū)的半側(cè)頸部皮膚，外擴(kuò)1 cm左右)，取適量均勻涂抹，直至基本吸收，一日2次。另一側(cè)予以日?；咀o(hù)理。每日觀察并記錄患者雙側(cè)放射性皮炎程度。無(wú)論雙側(cè)任何一側(cè)出現(xiàn)4級(jí)的皮膚損傷或毒副反應(yīng)，則中止試驗(yàn)。如果雙側(cè)皮膚損傷均維持在小于/等于3級(jí)，則一直涂抹受試保護(hù)劑至放療結(jié)束。

1.2.4 觀察指標(biāo)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1)動(dòng)物觀察指標(biāo)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物接受照射后每天觀察照射區(qū)域的皮炎情況并進(jìn)行評(píng)分，采用Douglas and Fowler評(píng)分方法[9](如表1)。觀察并記錄大鼠體重變化情況并記錄死亡情況。

表1 Douglas and Fowler放射性皮炎評(píng)分[9]

2)患者觀察指標(biāo)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。使用急性放射性反應(yīng)RTOG (Radiation therapy oncology group)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：基本無(wú)變化；I級(jí)：水泡、輕度紅斑/脫發(fā)/干性脫屑/流汗減少；II級(jí)：明顯紅斑，塊狀濕性脫屑/中度水腫；III級(jí)：皮膚皺褶部位以外的融合的濕性脫屑，凹陷性水腫；IV級(jí)：潰瘍、出血、壞死。觀察出現(xiàn)各級(jí)皮膚損傷的時(shí)間(RTOG分級(jí)標(biāo)準(zhǔn))以及與未涂抹受試保護(hù)劑的對(duì)照側(cè)相比，受試保護(hù)劑是否對(duì)單側(cè)頸部皮膚的放射性損傷降級(jí)。

1.2.5 動(dòng)物取材

照射后20 d，使用1 mm毛細(xì)管行大鼠活體眼眶取血，20 min離心(2000 r/min)，取上層清液即為血清，標(biāo)記后于-80 ℃冰箱保存。照射后28 d用2%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，用手術(shù)剪剪取照射部位的皮膚組織，大小約1.0 cm×1.0 cm，剪取全層，其中一部分組織用4%多聚甲醛固定，固定時(shí)間超過(guò)24 h。一部分組織立刻放入液氮中，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.2.6 病理學(xué)檢測(cè)

使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋，進(jìn)行切片，行蘇木素伊紅(HE)染色，免疫組化(IHC)染色檢測(cè)CD68，觀察CD68在皮膚組織的表達(dá)分布情況。

1.2.7 血清學(xué)檢測(cè)

使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)方法檢測(cè)血清中IL-6及MCP-1的含量。

1.2.8 組織學(xué)檢測(cè)

使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)組織中Arg-1含量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，用重復(fù)測(cè)量的方差分析統(tǒng)計(jì)皮炎評(píng)分與體重變化情況，使用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)CD68+、IL-6、MCP-1及Arg-1表達(dá)情況，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)物一般情況

各組動(dòng)物在觀察期間均未出現(xiàn)死亡。動(dòng)物放療期間體重情況如圖1。對(duì)比空白組，各組(預(yù)防組、口服給藥組、治療組和照射模型組)動(dòng)物體重?zé)o顯著性差異，P值分別為0.750、0.451、0.092和0.192。

圖1 放療期間動(dòng)物體重變化

2.2 動(dòng)物放射性皮炎特征

2.2.1 外觀特征

接受電子線(xiàn)照射后的4組大鼠于接受放療后第9或第10天時(shí)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的急性放射性皮炎表現(xiàn)：紅斑、脫毛，進(jìn)而出現(xiàn)薄紙樣改變、痂皮樣改變，于第15至第18天達(dá)高峰；后皮炎表現(xiàn)逐漸好轉(zhuǎn)，痂皮脫落。各組大鼠臀背部皮膚放射性皮炎表現(xiàn)如圖2，其皮炎評(píng)分結(jié)果如圖3。對(duì)比模型組，預(yù)防組、口服給藥組和治療組動(dòng)物皮炎較前顯著好轉(zhuǎn)，P值分別為0.003、0.030和0.037。

2.2.2 鏡下特征

HE染色可見(jiàn)對(duì)照組的表皮、真皮結(jié)構(gòu)正常，真皮內(nèi)存在豐富的毛囊結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)正常皮膚褶皺結(jié)構(gòu)；模型組的部分動(dòng)物表皮層各層結(jié)構(gòu)分界未見(jiàn)，結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)壞死，部分表皮層結(jié)構(gòu)消失。真皮層內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表皮層與真皮層結(jié)構(gòu)分離，未見(jiàn)毛囊及皮脂腺，未見(jiàn)皮膚褶皺；使用柚皮素的3組表皮層可見(jiàn)，真皮層與其分界清晰，部分出現(xiàn)分離，毛囊及皮脂腺未見(jiàn)，皮膚褶皺未見(jiàn)；表皮層各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂，真皮層內(nèi)可見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。圖4為光鏡下HE染色結(jié)果(100×)。

圖2 各組動(dòng)物放療后不同時(shí)間點(diǎn)急性放射性皮炎的表現(xiàn)

圖3各組動(dòng)物放射性皮炎評(píng)分

IHC檢測(cè)局部組織內(nèi)CD68陽(yáng)性表達(dá)情況：400倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD68+細(xì)胞數(shù)，取均值，空白組、模型組、預(yù)防組、口服給藥組及治療組CD68+細(xì)胞數(shù)分別為：0.75、12.91、7.70、3.13和8.30(圖5)。模型組CD68+細(xì)胞數(shù)較空白組顯著增加(P=0.004)，使用柚皮素的3組，CD68+細(xì)胞數(shù)較模型組下降，其中口服給藥組具有顯著性差異(P=0.005)。光鏡下觀察用IHC方法檢測(cè)皮膚組織中CD68+細(xì)胞表達(dá)(圖6，400×)。

“#”：對(duì)比空白組，P=0.004;“*”：對(duì)比模型組，P=0.005

圖6 放療后第28天各組照射區(qū)域皮膚CD68免疫組化染色結(jié)果(400×)

2.2.3 ELISA檢測(cè)放療后第20天動(dòng)物血清內(nèi)IL-6含量

為研究大鼠血清內(nèi)炎癥情況，使用ELISA檢測(cè)大鼠放療后第20天血清內(nèi)IL-6的表達(dá)情況，空白組、模型組、預(yù)防組、口服給藥組及治療組IL-6平均值分別為23.33、260.21、36.25、22.37和65.35 pg/mL。對(duì)比空白組，放射線(xiàn)可以顯著增加大鼠體內(nèi)IL-6的表達(dá)(P<0.01)，3種使用柚皮素的方式均可以顯著降低放射所致的IL-6的升高(P<0.01)(圖7)。

2.2.4 ELISA檢測(cè)放療后第20天動(dòng)物血清內(nèi)MCP-1含量

MCP-1即單核細(xì)胞趨化蛋白-1，其對(duì)單核細(xì)胞具有趨化活性，可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。因第一部分結(jié)果顯示，放療可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞在真皮層的聚集，因此我們進(jìn)一步使用ELISA檢測(cè)MCP-1在循環(huán)中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：空白組、模型組、預(yù)防組、口服給藥組及治療組MCP-1平均值為335.73、497.94、389.67、380.11和367.07 pg/mL。對(duì)比空白組，放射線(xiàn)可以顯著增加大鼠體內(nèi)MCP-1的表達(dá)(P=0.004)，3種使用柚皮素的方式均可以顯著降低放射所致的IL-6的升高(P= 0.04、0.036、0.021，圖8)。

“#”:對(duì)比空白組，P<0.01;“*”:對(duì)比模型組，P<0.01

圖8 各組大鼠放療后第20天血清中MCP-1表達(dá)量

2.2.5 qPCR檢測(cè)放療后第28天動(dòng)物局部組織Arg1量

Arg1是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志分子，可抑制炎癥反應(yīng)。為研究放療所致的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及柚皮素降低巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是否是通過(guò)該途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，我們于放療后28 d取大鼠放療區(qū)域局部組織，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，5組結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖9)。

2.3 患者放射性皮炎表現(xiàn)

11名患者均未出現(xiàn)III級(jí)以上放射性皮炎。試驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)在觀察結(jié)束時(shí)均為II級(jí)放射性皮炎表現(xiàn)。即使用柚皮素乳膏一側(cè)放射性皮炎程度較對(duì)照側(cè)皮炎程度均無(wú)加重。其中1名患者因雙側(cè)頸部皮膚疼痛感明顯，自行加用其他藥物治療，其余10名患者均每日涂抹柚皮素直至放療結(jié)束。所有患者均未出現(xiàn)無(wú)法耐受的副反應(yīng)。2人用藥側(cè)好于對(duì)照側(cè)，表現(xiàn)為用藥側(cè)頸部皮膚出現(xiàn)II°皮損時(shí)間晚于對(duì)照側(cè)10 d左右，其余8人雙側(cè)頸部皮炎情況未見(jiàn)區(qū)別。

圖9 各組大鼠放療后第28天組織中Arg1 mRNA量(P>0.05)

3 討論與結(jié)論

已有的實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于急性放射性皮炎，蘆薈[10]、激素[11]、三乙醇胺[12]、水化膜[13]等可能具有一定的防治效果，但是其有效性具有一定的局限，且缺少大樣本的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)。對(duì)于急性放射性皮炎的治療尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)治療方式，因此研究人員期望發(fā)現(xiàn)更多更有效的藥物成分，以更好地防治急性放射性皮炎，而柚皮素作為一種富含于水果中的黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗腫瘤等作用。已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，包含柚皮素在內(nèi)的黃酮類(lèi)混合物在小鼠體內(nèi)可起到一定的保護(hù)作用[14]，可以減少放射線(xiàn)照射對(duì)于動(dòng)物的致死作用，其對(duì)于紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的放射線(xiàn)皮膚損傷同樣具有保護(hù)作用[15]。而對(duì)于柚皮素的基礎(chǔ)研究證實(shí)，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥狀態(tài)來(lái)影響心血管疾病的發(fā)生，肺纖維化及腫瘤的轉(zhuǎn)移等疾病過(guò)程[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柚皮素可以降低動(dòng)物急性放射性皮炎的表現(xiàn)，其中預(yù)防治療組的效果最佳，在機(jī)制研究方面，CD68為單核巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志，在使用柚皮素之后，無(wú)論何種給藥方式，均可以降低其表達(dá)。MCP-1即單核細(xì)胞趨化蛋白，可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物血清中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，放射線(xiàn)可以增加其表達(dá)，而柚皮素可降低其增加程度，進(jìn)一步證實(shí)了單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在急性放射性皮炎發(fā)生中的作用，以及柚皮素降低急性放射性皮炎程度這一過(guò)程中所扮演的角色。IL-6是一種由包括單核-巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞分泌的具有復(fù)雜生理功能的細(xì)胞因子，已有的研究發(fā)現(xiàn)，放射線(xiàn)可導(dǎo)致炎性因子IL-6的大量釋放[18]。Okunieff等[19]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)放療所致的急慢性皮炎具有保護(hù)作用，其可以降低放射線(xiàn)所致的皮膚組織中IL-6 mRNA表達(dá)。因而，我們猜測(cè)柚皮素可以通過(guò)降低放療所致循環(huán)中IL-6水平的升高來(lái)降低放射性皮炎的表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)比空白組，放射線(xiàn)可以顯著增加大鼠體內(nèi)IL-6的表達(dá)(P<0.01)，3種使用柚皮素的方式均可以顯著降低放射所致的IL-6的升高(P<0.01)。因此我們認(rèn)為柚皮素可以通過(guò)降低單核細(xì)胞趨化蛋白對(duì)于單核巨噬細(xì)胞的趨化作用，降低單核巨噬細(xì)胞在放射性皮炎中所發(fā)揮的作用，進(jìn)而可以降低以IL-6為代表的炎性因子的釋放。巨噬細(xì)胞家族在功能方面具有異質(zhì)性[20]， M1和M2型巨噬細(xì)胞作為其功能狀態(tài)的兩種極端，在免疫應(yīng)答功能方面具有相反作用[21]。M1 型巨噬細(xì)胞是一種發(fā)揮正向免疫應(yīng)答作用的細(xì)胞，可以通過(guò)分泌促炎細(xì)胞因子及趨化因子，提呈抗原，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能；而 M2 型巨噬細(xì)胞功能相反，其僅有較弱抗原提呈能力，并可以通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子 IL-10 和/或TGF-β等抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)[22]。Arg-1是M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志，我們假設(shè)柚皮素降低急性炎癥反應(yīng)是通過(guò)上調(diào)以Arg-1為表面標(biāo)志的M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)來(lái)下調(diào)免疫應(yīng)答，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組之間Arg-1無(wú)顯著性差異，因此柚皮素可能通過(guò)其他途徑降低其炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)需要補(bǔ)充檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況來(lái)明確其是否可通過(guò)降低M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)來(lái)影響巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。

在臨床觀察中，我們初步證實(shí)柚皮素乳膏是安全的，其不會(huì)加重患者放射性皮炎程度，但有效性十分有限，需要進(jìn)一步探究。11名患者中2名患者能延緩出現(xiàn)II°放射性皮炎的時(shí)間，但無(wú)法停留在I°放射性皮炎。考慮與局部皮膚吸收柚皮素成分有限相關(guān)，且每日涂抹2次，操作上可能加重皮損程度，因此柚皮素可否作為臨床上治療甚至預(yù)防放射性皮炎的藥物，需要進(jìn)一步的研究及發(fā)現(xiàn)，本臨床觀察納入患者數(shù)目有限，需要更大樣本數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)明柚皮素的安全性及有效性。