申有名，楊玉芬，谷 標(biāo)*

(1.湖南文理學(xué)院 水處理功能材料湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 常德 415000；2.衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，功能金屬有機(jī)化合物湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008)

作為一種活性氧物質(zhì)，次氯酸(HClO)/次氯酸根(ClO-)在生物體內(nèi)起著非常重要的作用。內(nèi)源性次氯酸由白細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)中的髓過氧化物酶催化過氧化氫和氯離子反應(yīng)而生成[1-2]。研究表明體內(nèi)正常含量的次氯酸/次氯酸根可維持基本的生命活動(dòng)，同時(shí)在免疫系統(tǒng)中起到防御疾病的作用。然而，異常濃度的次氯酸/次氯酸根(≥1 000 mg/L)則會引起體內(nèi)生物分子氧化，進(jìn)而導(dǎo)致各種生理疾病，包括關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化和癌癥[3-5]。因此，開發(fā)一種可靠、有效的次氯酸/次氯酸根檢測和成像的方法在生物醫(yī)學(xué)研究和疾病診斷方面具有重要的意義。

在眾多方法中，熒光探針因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、響應(yīng)時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，為體外和體內(nèi)檢測提供了可能[6-7]。迄今為止，已報(bào)道了許多以二苯甲酰肼、羥胺、酰肼、對甲基苯酚等作為次氯酸/次氯酸根識別基團(tuán)的熒光探針[8-10]。然而，用于次氯酸/次氯酸根檢測的熒光探針仍存在合成復(fù)雜、純化困難、反應(yīng)時(shí)間長、選擇性差等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。因此，研制一種簡單、有效、可用于次氯酸/次氯酸根檢測和成像的熒光探針十分必要。

菲并咪唑廣泛用于有機(jī)發(fā)光二極管器件，具有較高的熒光量子產(chǎn)率、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性[11]。更重要的是，該類物質(zhì)合成簡單，且可通過改變苯環(huán)取代基種類改變分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程(ICT)，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號調(diào)控[12-14]。鑒于當(dāng)前次氯酸/次氯酸根熒光探針存在的諸多不足和菲并咪唑優(yōu)異的光學(xué)性能，本文設(shè)計(jì)并合成了一種2-(4’-甲基硫基苯基)苯并咪唑(MPI)探針。該探針由商用試劑9,10-菲醌和4-(甲基巰基)苯甲醛通過一步反應(yīng)生成，只需簡單過濾水洗即可得到大量純凈的產(chǎn)品(產(chǎn)率達(dá)85%)。探針MPI以菲并咪唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)，甲基苯基硫?yàn)樽R別基團(tuán)。由于硫原子具有重原子效應(yīng)[15]，探針熒光微弱。但在次氯酸存在下，探針分子內(nèi)具有供電子性質(zhì)的硫原子被氧化成具有拉電子性質(zhì)的亞砜，重原子效應(yīng)減弱，同時(shí)ICT效應(yīng)加強(qiáng)，可在光激發(fā)下引起熒光增強(qiáng)信號。研究發(fā)現(xiàn)探針MPI對次氯酸檢測時(shí)具有反應(yīng)快(3 min)，靈敏度高和選擇性好的特點(diǎn)。熒光成像實(shí)驗(yàn)表明該探針具有良好的生物相容性和和細(xì)胞滲透性，可用于活細(xì)胞內(nèi)次氯酸的可視化檢測。因此，本研究為機(jī)體內(nèi)次氯酸的檢測與追蹤提供了一種簡單且有效的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

1H NMR和13C NMR通過Bruker AVANCE-500M型核磁共振儀測得。ESI-HRMS 經(jīng)Brucker APEX IV(7.0 T)FTMS型高分辨質(zhì)譜儀測得。熒光光譜在RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(Shimazu Co.，Japan)上測定。細(xì)胞成像圖在倒置熒光顯微鏡(NIKON Eclipse Ti-S，Japan)下獲得。

9,10-菲醌、4-(甲基巰基)苯甲醛、醋酸銨和冰醋酸購于安耐吉化學(xué)有限公司。其他分析純試劑購于國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。所用去離子水(≥ 18 MΩ·cm)由Milli-Q純化系統(tǒng)制備。

1.2 探針2-(4’-甲基硫基苯基)苯并咪唑(MPI)的合成與表征

向100 mL的圓底燒瓶中依次加入9,10-菲醌(208 mg,1.0 mmol)，4-(甲基巰基)苯甲醛(183 mg,1.2 mmol)，醋酸銨(305 mg,5.0 mmol)和冰醋酸(30 mL)，使混合液在120 ℃下反應(yīng)5 h。將瓶中液體倒入冷水(30 mL)中，可觀察到有白色沉淀物質(zhì)產(chǎn)生。通過布氏漏斗過濾，收集濾渣，用去離子水淋洗3次，經(jīng)烘箱干燥(55 ℃)后得純凈的灰色粉末MPI(288 mg,85%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ8.63-8.54(m，2H)，8.42-8.30(m，2H)，7.88(d，J=8.3 Hz，2H)，7.60-7.50(m，4H)，6.88(d，J=8.2 Hz，2H)，2.32(s，4H)。13C NMR(126 MHz，CDCl3)：δ148.42，141.22，131.30，130.03，128.41，127.00，126.35，125.68，125.48，125.21，123.78，123.60，121.82，14.94。MPI(C22H17N2S+)的理論相對分子質(zhì)量為341.110 7，實(shí)測值為341.113 5。

1.3 光譜測試

用萬分之一分析天平準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的探針MPI，以色譜純的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配成1 mmol/L的儲備液。活性氮及活性氧物種等其他分析物的儲備液(1 mmol/L)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法配制[16]。

樣品溶液的配制：向25.00 mL容量瓶中加入0.25 mL的MPI儲備液和適量體積的與生物相關(guān)的離子、活性氮及活性氧物種等分析物儲備液(1 mmol/L)，配成待測物的PBS溶液(DMF>∶H2O=2>∶8，體積比，pH 7.4)。待樣品溶液孵育3 min后，在熒光分光光度計(jì)上測試熒光光譜。采用385 nm的光輻射作為激發(fā)光，記錄395～600 nm之間的發(fā)射光譜。

1.4 熒光成像

將HeLa細(xì)胞放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，含5% CO2)中，用含有100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素以及10%小牛胚胎血清的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)。在進(jìn)行細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)之前，先將HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中生長24 h。取一部分上述細(xì)胞與探針MPI共孵育30 min，作為空白組；取另一部分細(xì)胞先與探針MPI共孵育30 min后，再與NaOCl(50 μmol/L)共孵育10 min，作為實(shí)驗(yàn)組。用溫?zé)岬腜BS緩沖溶液(37 ℃，pH 7.4)清洗細(xì)胞外殘余的探針。最后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄兩組細(xì)胞的圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 識別性能研究

為了證明探針識別次氯酸的能力，測試了MPI與次氯酸反應(yīng)前后的紫外光譜和熒光光譜。從圖1A可以看出，探針MPI的紫外光譜在330 nm和365 nm處有2個(gè)吸收峰。加入次氯酸后，330 nm處的紫外吸收消失，同時(shí)365 nm處的吸收變?nèi)?。圖1B顯示，探針MPI在385 nm光輻射下展現(xiàn)微弱的熒光信號，這主要是由于探針分子結(jié)構(gòu)中硫原子的重原子效應(yīng)所致。然而，在加入次氯酸后，探針在445 nm處的熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)。這些初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針可以在水溶液中通過熒光光譜法檢測次氯酸。

2.2 檢測機(jī)理

基于探針MPI與次氯酸作用前后的熒光變化，推測探針分子上的硫原子在次氯酸的氧化下轉(zhuǎn)化為亞砜。為證實(shí)這一假設(shè)，以高分辨質(zhì)譜對探針MPI進(jìn)行表征。如圖2A所示，探針在m/z=341.113 5處有1個(gè)強(qiáng)的分子離子峰。探針與次氯酸反應(yīng)后溶液的高分辨質(zhì)譜圖見圖2B，反應(yīng)混合物在m/z=357.105 4處有1個(gè)很強(qiáng)的分子離子峰，其質(zhì)荷比與探針MPI不同，與化合物2-(4’-甲基亞砜基苯基)苯并咪唑(SPI)的相對分子質(zhì)量(m/z=357.105 6)一致，這表明探針上的硫原子確實(shí)被次氯酸氧化成亞砜。根據(jù)熒光光譜和高分辨質(zhì)譜的結(jié)果，提出如下機(jī)理：熒光基團(tuán)菲并咪唑由于硫原子的重原子效應(yīng)導(dǎo)致熒光較弱；當(dāng)硫原子被次氯酸氧化成亞砜后，重原子效應(yīng)減弱，同時(shí)熒光分子ICT效應(yīng)增強(qiáng)，在光激發(fā)下產(chǎn)生熒光增強(qiáng)信號(圖3)。因此，利用次氯酸和探針之間的氧化還原反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)次氯酸濃度-熒光強(qiáng)度之間的信號轉(zhuǎn)換，達(dá)到熒光檢測次氯酸的目的。

圖3 MPI探針檢測次氯酸的機(jī)理示意圖Fig.3 Proposed sensing mechanism of MPI with HClO

圖4 MPI熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化關(guān)系圖Fig.4 Time-course fluorescence response of MPI(10 μmol/L) towards HOCl in PBS buffer(DMF>∶H2O=2>∶8,by volume,pH 7.4)

2.3 響應(yīng)時(shí)間與選擇性

為了探究探針與次氯酸反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，考察了探針MPI與次氯酸混合后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況。從圖4可以看出，反應(yīng)體系熒光隨著時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，3 min后達(dá)到飽和，因此，選擇3 min作為探針與次氯酸的反應(yīng)時(shí)間。

2.4 靈敏性

為了考察探針對次氯酸檢測的靈敏性，測試了MPI(10 μmol/L)與不同濃度的次氯酸(0～100 μmol/L)在PBS緩沖液(DMF>∶H2O=2>∶8，體積比，pH 7.4)中孵育3 min后的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)探針的發(fā)射光譜強(qiáng)度隨著次氯酸濃度的增加而上升。通過數(shù)據(jù)擬合，發(fā)現(xiàn)探針在445 nm處的熒光強(qiáng)度(Y)與次氯酸的濃度(X，0～100 μmol/L)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=2.329 5X+32.122 9，線性系數(shù)為0.997 7。根據(jù)檢出限計(jì)算公式(LOD=3σ/k，σ為空白樣品連續(xù)測定11次的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)[17]，得到方法檢出限為0.26 μmol/L。相比文獻(xiàn)報(bào)道的次氯酸探針(表1)，MPI具有較低的檢出限。上述結(jié)果說明MPI可以高靈敏、定量檢測次氯酸。

表1 檢測HClO/ClO-熒光探針的比較Table 1 Comparison of fluorescence probes for detection of HClO/ClO-

2.5 細(xì)胞成像

基于探針優(yōu)異的識別性能(響應(yīng)快(3 min)，適用于生理pH值(7.4)，高的靈敏性和選擇性)，利用MPI對細(xì)胞內(nèi)的次氯酸進(jìn)行熒光成像，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)HeLa細(xì)胞與探針MPI共孵育30 min后，細(xì)胞內(nèi)部無熒光信號(圖6B)。然而，將預(yù)處理的HeLa細(xì)胞與次氯酸共孵育10 min后，可以觀察到明亮的藍(lán)色熒光(圖6D)。從明場成像圖可知，細(xì)胞生長正常，表明MPI具有較好的生物相容性。上述實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)前探針具有良好的細(xì)胞膜通透性，適合于細(xì)胞內(nèi)次氯酸的成像分析。

圖6 HeLa細(xì)胞與MPI共孵育30 min(A,B)和經(jīng)MPI處理的HeLa細(xì)胞與次氯酸共孵育10 min(C,D)后的明場圖以及熒光圖Fig.6 Bright field images and fluorescence images of HeLa cells incubated with MPI(10 μmol/L) for 30 min(A,B) and MPI pretreated HeLa cells and again treated with HClO(50 μmol/L) for 10 min(C,D) bright field image:A,C;fluorescence image:B,D

3 結(jié) 論

本研究以菲并咪唑?yàn)闊晒鈭F(tuán)，甲基苯基硫?yàn)樽R別位點(diǎn)，通過簡單一步反應(yīng)成功得到一種熒光增強(qiáng)型的次氯酸熒光探針MPI。該探針簡單易得，無需復(fù)雜的純化過程。分析結(jié)果表明探針MPI對次氯酸的熒光分析具有響應(yīng)快速(3 min)，選擇性高和檢出限低(0.26 μmol/L)的特征。更重要的是，探針MPI具有良好的細(xì)胞相容性，在HeLa活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了次氯酸的可視化熒光成像。因此，本研究為深入研究生物體內(nèi)次氯酸的功能與作用提供了一種簡單且有效的工具。