魏泉增，臧蓓蕾，肖付剛

（1.許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南許昌461000；2.許昌學(xué)院河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南許昌461000）

蜂蜜中的揮發(fā)性成分不僅是蜂蜜品質(zhì)的重要組成部分，也是蜂蜜種類差異性的重要體現(xiàn)。蜂蜜中包含了400多種不同的化學(xué)物質(zhì)，95%以上是糖和水，其中包括大約38.5%的果糖、31%為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和其他復(fù)雜的碳水化合物，以及不到5%的少量物質(zhì)，包括蛋白、維生素（主要是 VB6、VB1、煙酸、核黃素、VB5）、礦物質(zhì)（包括鈣、銅、鐵、鎂、錳、磷、鉀、鈉和鋅），色素，香味物質(zhì)，游離氨基酸[1]。單萜類、倍半萜類、苯的衍生物、高級(jí)醇、酯類、脂肪酸、酮、萜類、醛類等揮發(fā)性物質(zhì)與蜜源植物類別有關(guān)[2]。所以，蜂蜜中的揮發(fā)性成分可以用來(lái)作為蜂蜜來(lái)源的標(biāo)記物[3]，用來(lái)鑒定蜂蜜的蜜源。

傳統(tǒng)揮發(fā)性成分提取方法有同時(shí)蒸餾萃取[4-5]、溶劑萃取法[6-8]、超聲輔助萃取法[9]、動(dòng)態(tài)頂空分析[10]和固相微萃取法[11-12]。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有一些對(duì)單花蜜揮發(fā)性成分的報(bào)道，涂世等[9]通過(guò)超聲輔助萃取法對(duì)油菜單花蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。粟有志等[13]對(duì)采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）法與氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析新疆4種單花蜜揮發(fā)性組分，確立了每種單花蜜的特征性組分。L.Castro-Va’zquez等[14]確定了西班牙柑橘蜂蜜的特征性成分，主要為萜類物質(zhì)。這些提取方法中，同時(shí)蒸餾萃取有可能產(chǎn)生新物質(zhì)，超聲輔助萃取，提取物質(zhì)種類較少，溶劑萃取只能提取與溶劑極性相似的物質(zhì)。固相微萃取技術(shù)是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種用于富集揮發(fā)性化合物的新技術(shù)，無(wú)需溶劑，操作簡(jiǎn)便，已廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性、半揮發(fā)性物質(zhì)的分析[15]。

蜂蜜的揮發(fā)性成分主要來(lái)自于蜜源植物[16]，因此本研究選用了8種不同蜜源的蜂蜜作為研究對(duì)象。采取頂空固相微萃取的提取方法，GC-MS分析8種不同蜜源蜂蜜的揮發(fā)性成分，確定蜂蜜的潛在標(biāo)記物，以期望通過(guò)揮發(fā)性成分來(lái)鑒定不同蜜源蜂蜜奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器

荊條蜜、荊花蜜、棗花蜜、野酸棗蜜、苕子蜜、椴樹(shù)蜜、洋槐蜜、野山花蜜：卓宇蜂業(yè)采購(gòu)部。

7890B-7000C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；A1004N電子天平：上海菁海儀器有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器有限公司；萃取手柄和萃取頭：青島貞正分析儀器有限公司。

C6～C10及C8～C40正構(gòu)烷烴：百靈威科技有限公司；15 mL頂空瓶：安捷倫公司。

1.2 樣品前處理

1 mL的蜂蜜置于15 mL頂空瓶中，65℃恒溫水浴，平衡20 min，采用活性炭/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）涂料萃取頭，65 ℃頂空吸附20 min，進(jìn)樣口250℃解吸附3 min，色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜條件：1701色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣 He（99.999%）；恒流，柱流速為 1 mL/min；分流比為 10 ∶1；進(jìn)樣口溫度為 250 ℃；壓力：19.93 kPa；升溫程序：溫度50℃保持4 min，以3℃/min升至130℃，以8℃/min升至205℃，再以4℃/min升至250℃。

質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，四級(jí)桿溫度150℃，離子源溫度230℃，掃描模式Scan，掃描范圍29 amu～700 amu。

1.4 成分鑒定

利用GC-MS的NIST14譜庫(kù)對(duì)所得質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索和分析，以質(zhì)譜匹配度＞600作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）并與文獻(xiàn)中的RI相互比較，RI按公式（1）計(jì)算。用峰面積表示化合物的相對(duì)含量，化合物香味采用http：//flavornet.org數(shù)據(jù)庫(kù)中的描述。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)excel統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用PAST軟件，采用Jaccard法對(duì)不同蜜源蜂蜜進(jìn)行相似度聚類分析，采用模型Var-covar對(duì)不同蜜源蜂蜜進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分分析

8種蜂蜜中的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括醇類、酯類、醛類、烯類、烷類、酚類等，不同種類揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，棗花蜜中胺類物質(zhì)含量最多。荊條蜜苯類物質(zhì)、烯類物質(zhì)和酯類物質(zhì)含量最多；8種蜂蜜中醇類物質(zhì)含量相當(dāng)。棗花蜜中酚類物質(zhì)含量最多。野山花蜜醛類物質(zhì)含量最多。洋槐蜜、野酸棗蜜和棗花蜜中檢測(cè)到酸類物質(zhì)，且在洋槐蜜中的含量最高。野酸棗蜜酮類含量最多。荊花蜜和苕子蜜的揮發(fā)性物質(zhì)種類含量偏低。

2.2 不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分比較

圖1 不同蜜源蜂蜜的揮發(fā)性成分Fig.1 Volatile components of honey from different honey sources

比較不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分（醇類、酯類、醛類、烯類、酚類、烷類、酮類）的差異，分析結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，8種蜂蜜共檢測(cè)出59種揮發(fā)性物質(zhì)，椴樹(shù)蜜中有30種，荊花蜜中有21種，荊條蜜中有16種，苕子蜜中有18種，洋槐蜜中有24種，野山花蜜中有27種，野酸棗蜜中有24種，棗花蜜中有32種。8種蜂蜜中共檢出9種醇類物質(zhì)，椴樹(shù)蜜檢出4種、荊花蜜檢出4種、荊條蜜檢出1種、苕子蜜檢出2種、洋槐蜜檢出3種、野山花蜜檢出6種、野酸棗蜜檢出4種、棗花蜜檢出7種，結(jié)果表明：醇類物質(zhì)在8種蜂蜜中差異明顯。2，6-二甲基-3，7-辛二烯-2，6-二醇僅存在于棗花蜜中；芐醇只存在于洋槐蜜中，具有甜味和花香味。8種蜂蜜中含量最多的醇是3，7-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-醇，其中棗花蜜中含量最多。芳香醇是脫氫芳香醇，是芳樟醇氧化物的前體物質(zhì)。芳樟醇脫氫可能發(fā)生在蜂蜜的保存過(guò)程中。由于溫度、pH值和酶活等條件，芳樟醇的含量有顯著的差異。脫氫芳樟醇并沒(méi)有檢測(cè)到，但是檢測(cè)到了2，6-二甲基-3，7-辛二烯-2，6-二醇，它也有可能是芳樟醇的前體物質(zhì)[17-18]。

表1 HS-SPME提取蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Extraction of volatile compounds from honey by HS-SPME

續(xù)表1 HS-SPME提取蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)Contimue table 1 Extraction of volatile compounds from honey by HS-SPME

續(xù)表1 HS-SPME提取蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)Contimue table 1 Extraction of volatile compounds from honey by HS-SPME

8種蜂蜜中共檢出12種酯類物質(zhì)，椴樹(shù)蜜檢出6種、荊花蜜檢出3種、荊條蜜檢出3種、苕子蜜檢出3種、洋槐蜜檢出4種、野山花蜜檢出3種、野酸棗蜜檢出4種、棗花蜜檢出6種。結(jié)果表明：苯乙酸-2-苯基乙酯、1，3-亞苯基-雙（3-苯基丙烯酸酯）只在洋槐蜜中出現(xiàn)；異丙醇，2-苯基乙酯在棗花蜜中未檢出；生物堿乙酸甲酯是這8種蜂蜜共有的物質(zhì)。

8種蜂蜜中共檢測(cè)出12種醛類物質(zhì)，椴樹(shù)蜜檢出7種、荊花蜜檢出3種、荊條蜜檢出3種、苕子蜜檢出4種、洋槐蜜檢出3種、野山花蜜檢出8種、野酸棗蜜檢出8種、棗花蜜檢出5種，結(jié)果表明：醛類物質(zhì)在8種蜂蜜中差異明顯，5-甲基-2-呋喃甲醛只存在于野酸棗蜜中，壬醛是10種蜂蜜共有的成分，在棗花蜜中含量最多，椴樹(shù)蜜中含量最少。

8種蜂蜜中共檢測(cè)出7種烯類物質(zhì)，椴樹(shù)蜜檢出3種、荊花蜜檢出2種、荊條蜜檢出3種、苕子蜜檢出1種、洋槐蜜檢出3種、野山花蜜檢出2種、野酸棗蜜檢出1種、棗花蜜檢出3種，結(jié)果表明：烯類物質(zhì)在8種蜂蜜中差異較小，D-檸檬烯僅存在于洋槐蜜中，10種蜂蜜中含量最多的烯是α-依蘭油烯。

8種蜂蜜中共檢測(cè)出4種酚類物質(zhì)，椴樹(shù)蜜檢出3種、荊花蜜檢出3種、荊條蜜檢出2種、苕子蜜檢出2種、洋槐蜜檢出2種、野山花蜜檢出2種、野酸棗蜜檢出2種、棗花蜜檢出2種，結(jié)果表明：酚類物質(zhì)在4種蜂蜜中差異很小，4，4-（1-甲基亞乙基）雙 [2，6-二甲基]-苯酚僅存在于椴樹(shù)蜜中，3，5-雙（1，1-二甲基乙基）苯酚僅存在于荊花蜜中，乙底酚（具有青草味和甜味）、地衣酚是8種蜂蜜的共有物質(zhì)。

8種蜂蜜中共檢測(cè)出4種烷類物質(zhì)，椴樹(shù)蜜檢出4種、荊花蜜檢出3種、荊條蜜檢出3種、苕子蜜檢出3種、洋槐蜜檢出3種、野山花蜜檢出3種、野酸棗蜜檢出2種、棗花蜜檢出3種，結(jié)果表明：烷類物質(zhì)在4種蜂蜜中差異明顯，十二甲基環(huán)己烷是8種蜂蜜共有的成分。

8種蜂蜜中共檢測(cè)出4種酮類物質(zhì)，椴樹(shù)蜜檢出1種、荊花蜜檢出1種、荊條蜜未檢出、苕子蜜未檢出、洋槐蜜檢出1種、野山花蜜未檢出、野酸棗蜜檢出1種、棗花蜜未檢測(cè)出，結(jié)果表明：酮類物質(zhì)在蜂蜜中含量較少，1-（1H-吡咯-2-基）乙酮僅存在于苕子蜜中，1-（2-氨基苯基）乙酮僅存在于野酸棗蜜中，8種蜂蜜中含量最多的酮類物質(zhì)是3-甲氧基-7，11，18-三乙酰氧基-3，9-環(huán)氧孕甾-16-烯-20-酮。

2.3 聚類分析

聚類分析是將樣品按照品質(zhì)特性的相似成對(duì)逐漸聚合在一起，相似度最大的優(yōu)先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質(zhì)多個(gè)品種聚合，從而完成聚類分析的過(guò)程[19]。不同蜜源蜂蜜進(jìn)行對(duì)比，如圖2所示。

相似度最高是苕子蜜和野山花蜜，相似度為0.6，其次是野酸棗蜜和椴樹(shù)蜜，相似度為0.55。結(jié)果表明：不同蜜源的蜂蜜揮發(fā)性成分明顯不同。這為利用蜂蜜揮發(fā)性成分鑒定不同蜜源蜂蜜提供了依據(jù)。

2.4 主成分分析

主成分分析（principal components analysis，PCA）是一種降維或者把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種多元梳理統(tǒng)計(jì)方法[19]。將8種蜂蜜的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分PCA的分值圖見(jiàn)圖3。

圖2 不同蜜源蜂蜜的聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of honey from different sources

圖3 PCA分值圖Fig.3 Score plot for PCA

第一主成分的貢獻(xiàn)率為62.4%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為18.6%，第三主成分的貢獻(xiàn)率為9.13%。8種不同蜜源大致可以分為3類，荊條蜜為一類，荊花蜜、野酸棗蜜、苕子蜜、椴樹(shù)蜜、洋槐蜜、野山花蜜為一類，棗花蜜為一類。

在PCA分值圖中，不同蜜源蜂蜜點(diǎn)的距離相距越遠(yuǎn)，不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分差異越明顯。揮發(fā)性化合物組成不同是區(qū)分不同蜜源蜂蜜的基礎(chǔ)，例如，5，5，8a-三甲基-3，5，6，7，8，8a-六氫-2h-鉻烯，芐醇，十六烷酸乙酯，壬醛與生物堿乙酸甲酯等物質(zhì)都可以作為區(qū)分不同蜜源的潛在物質(zhì)。但是，某些化合物在不同的蜜源中并不是總出現(xiàn)，例如，芐醇只在洋槐蜜中出現(xiàn)，這對(duì)于從8種蜜源中鑒定出洋槐蜜十分便利。但是，不足之處是僅僅用這一個(gè)潛在標(biāo)記物不能鑒定其他7種蜜源的蜂蜜。為了減少潛在標(biāo)記物的數(shù)量，采用在8種蜜源蜂蜜中都檢測(cè)到的壬醛與生物堿乙酸甲酯做為潛在標(biāo)記物，利用壬醛與生物堿乙酸甲酯峰面積的比值做為區(qū)分不同蜜源蜂蜜的依據(jù)。計(jì)算結(jié)果表明，在椴樹(shù)蜜中是2.90，在洋槐蜜中是3.53，在荊花蜜中是9.03，在荊條蜜中是16.76，在苕子蜜中是7.40，在野山花蜜中是8.47，在野酸棗中是8.63，在棗花蜜中是17.17，因此，采用壬醛與生物堿乙酸甲酯作為潛在特征物可以區(qū)分不同蜜源的蜂蜜。

3 結(jié)論

用HS-SPME法對(duì)8種不同蜜源的真蜂蜜的揮發(fā)性成進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果表明，1 mL的蜂蜜置于15 mL頂空瓶中，采用CAR/PDMS涂料萃取頭，GC-MS共鑒定出59種物質(zhì)，包括12種酯類、12種醛類、4種烷類、9種醇類、7種烯類、4種酚類、3種酮類、3種萘類、2種苯類、2種酸類、1種胺類。聚類分析結(jié)果表明：不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分組成的相似度不高。PCA分析結(jié)果表明：壬醛和生物堿乙酸甲酯可做為潛在特征物標(biāo)記物，利用蜂面積比值可以區(qū)分不同蜜源蜂蜜。這為不同蜜源蜂蜜的綜合利用和鑒定不同蜜源蜂蜜奠定了基礎(chǔ)。