賀子翔，夏 昕，覃玉芳，楊 浩，覃 迪，向星宇，胡俊忠，湛志飛

豬鏈球菌病(streptococcus suis disease)是由多種致病性豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)感染引起的一種人獸共患病[1]。豬鏈球菌是豬身上的一種常見的重要病原體，也可引起人的腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和肺炎[1-2]，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致永久性耳聾、中毒性休克綜合征(toxic shock syndro me，TSS)，甚至導(dǎo)致死亡[3-4]。豬鏈球菌根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，共分為35個(gè)血清型，即1～34型和1/2型，最常見的致病性血清型為2型[5-6]。2006年，湖南省報(bào)道了首例人感染豬鏈球菌病例，為豬鏈球菌2型[7]。此后，湖南省人感染豬鏈球菌病時(shí)有發(fā)生，人源分離株經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定也均為豬鏈球菌2型菌株。目前，國內(nèi)關(guān)于豬鏈球菌14型人源分離株的報(bào)道少見。本研究對(duì)2019年就診于湖南某醫(yī)院的1例疑似人感染豬鏈球菌病患者的關(guān)節(jié)液進(jìn)行了菌株分離鑒定與毒力分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病例信息 患者，男，61歲，為某屠宰廠門衛(wèi)。發(fā)病前7 d內(nèi)均有接觸外表健康豬，接觸手有1處結(jié)痂封閉的深度傷口，且接觸后未及時(shí)洗手。發(fā)病前7 d未接觸豬肉，接觸過豬肉熟食。2019年5月29日患者右膝腫痛并于同日入院。病發(fā)后最高體溫38℃，右膝腫脹明顯，浮髕試驗(yàn)陽性。

1.2 菌株來源 患者關(guān)節(jié)液。

1.3 試劑 血瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，VITEK 2革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡和藥敏卡(法國生物梅里埃公司)，豬鏈球菌2型和14型診斷血清(鄭州萬泰生物科技有限公司)，DNA提取試劑盒(QIAGEN DNeasy)PCR引物均購自寶生物工程有限公司，PCR試劑為Ex Taq酶(寶生物工程有限公司)。

1.4 儀器 VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃)，9700型PCR儀(Applied Biosystems公司)，全自動(dòng)核酸分析儀QIAxcel Advanced(Qiagen公司)。

1.5 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將關(guān)節(jié)液接種于血瓊脂平板分區(qū)劃線培養(yǎng)，置37℃，燭缸培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征。

1.6 革蘭氏染色鏡檢 挑取單個(gè)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并挑取符合豬鏈球菌鏡下特征的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板純培養(yǎng)，置37℃，燭缸培養(yǎng)24 h。

1.7 生化鑒定和藥物敏感實(shí)驗(yàn) 挑取適量新鮮的純培養(yǎng)菌落，配制菌懸液;填充VITEK 2革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡和藥敏卡，用VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定分析。

1.8 血清凝集試驗(yàn) 挑取新鮮純培養(yǎng)菌落分別與豬鏈球菌2型和14型診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)做生理鹽水對(duì)照。

1.9 菌株DNA模板提取 用生理鹽水制備濁度7-10 Ma F的菌懸液，用DNA提取試劑盒制備DNA模板，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 豬鏈球菌分子生物學(xué)檢測 參考文獻(xiàn)[5，7-10]合成引物，檢測豬鏈球菌種特異性基因(16S r RNA)，主要毒力因子基因:溶菌酶釋放相關(guān)蛋白(muramidase-released protein，mr p)、纖粘連蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin-binding proteins，f bps)、溶血素(suislysin，sl y)、細(xì)胞外因子(extracellular factor，ef)、谷氨酸脫氫酶(gl uta mate dehydrogenase，gdh)、毒力相關(guān)序列第二開放讀碼框(open reading fra me 2，or f 2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh)，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系[8]，20μL:Ex Taq HS 0.1μL，10×Ex Taq buffer(Mg2＋plus)2 μL，d NTP Mixt ure 1.6μL，上、下游引物各1μL，dd H2O 13.3μL，DNA模板1μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，退火(溫度見表1)30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用全自動(dòng)核酸分析儀電泳得出結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 菌落特征 培養(yǎng)24 h后，可疑菌株在血瓊脂平板上出現(xiàn)灰白色、光滑濕潤、凸起的小菌落，菌落周圍有較明顯的α溶血。見圖1。

2.2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果 油鏡下，細(xì)菌為革蘭氏陽性球菌，單個(gè)散在或短鏈狀排列。見圖2。

2.3 生化鑒定 VITEK2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)報(bào)告生化鑒定結(jié)果為豬鏈球菌2型(可能性99%)。

2.4 藥物敏感實(shí)驗(yàn) VITEK2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)報(bào)告藥敏實(shí)驗(yàn)見表2。分離株除對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素耐藥外，其余藥物均為敏感，且頭孢西丁耐藥機(jī)制篩選陰性。

2.5 血清凝集試驗(yàn) 分離菌株與豬鏈球菌14型診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，與豬鏈球菌2型診斷血清不發(fā)生凝集反應(yīng)，生理鹽水對(duì)照不發(fā)生凝集反應(yīng)。

表1 豬鏈球菌及相關(guān)毒力因子基因引物序列Tab.1 Primer sequences of Streptococcus suis and related Virulence genes

圖1 豬鏈球菌14型菌落形態(tài)Fig.1 Colony mor phology of Streptococcus suis type 14

2.6 PCR結(jié)果 豬鏈球菌種特異性基因(16S r RNA)陽性，2型莢膜多糖基因(cps 2J)陰性、14型莢膜多糖基因(cps 14J)陽性，毒力基因:溶血素(sl y)、纖粘連蛋白結(jié)合蛋白(f bps)、胞外因子(ef)、谷氨酸脫氫酶(gdh)、毒力相關(guān)基因(or f 2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因(gap dh)均為陽性，溶菌酶釋放相關(guān)蛋白(mr p)為陰性。結(jié)果見圖3。

表2 豬鏈球菌14型藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Drug sensitivity test results of Streptococcus suis type 14

圖3 豬鏈球菌14型PCR電泳結(jié)果Fig.3 PCR electrophoresis results of Streptococcus suis type 14

3 討 論

1968 年丹麥學(xué)者首次報(bào)道了3例人感染豬鏈球菌導(dǎo)致腦膜炎并發(fā)敗血癥病例，1975年荷蘭也出現(xiàn)了散發(fā)病例的報(bào)道[11]。1999年，董德平等[12]首次在國內(nèi)報(bào)道了人感染豬鏈球菌病病例，為豬鏈球菌2型。2005年，四川省發(fā)生大規(guī)模人感染豬鏈球菌病，204例病例，死亡39例，此次疫情由豬鏈球菌2型引起[13]。其他各省也有豬鏈球菌病散在病例報(bào)道。因此，對(duì)該菌的快速鑒定和分型以及毒力分析對(duì)患者的診治以及疫情的分析處置都尤為重要。此次為湖南省自2006年報(bào)道人感染豬鏈球菌2型病例后，首次檢出豬鏈球菌14型病例，表明了新型豬鏈球菌已在湖南省出現(xiàn)，在未來的疫情處置和患者診治中都需引起重視。

VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)是微生物快速檢測分析系統(tǒng)，馬麗梅等[14]應(yīng)用此系統(tǒng)對(duì)111株豬鏈球菌進(jìn)行了鑒定，110株被準(zhǔn)確鑒定為豬鏈球菌2型，還有1株被準(zhǔn)確鑒定為豬鏈球菌1型，認(rèn)為VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)能夠快速準(zhǔn)確檢測和鑒定豬鏈球菌2型，結(jié)果可靠。但是此系統(tǒng)也存在局限性，鑒定庫只有豬鏈球菌1型和豬鏈球菌2型兩種鑒定結(jié)果。本研究應(yīng)用此系統(tǒng)對(duì)可疑菌株進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果也顯示高鑒定度:豬鏈球菌2型(可能性99%)?？梢妼?duì)于非1型/2型豬鏈球菌，僅依靠此系統(tǒng)進(jìn)行鑒定可能會(huì)存在不準(zhǔn)確的情況。也正因?yàn)檫@種情況的存在，我們通過血清學(xué)試驗(yàn)和莢膜多糖基因檢測，分離株2型血清和2型莢膜多糖基因均陰性，14型血清和14型莢膜多糖基因均陽性，確認(rèn)分離到的病原菌為豬鏈球菌14型。

藥物敏感性實(shí)驗(yàn)對(duì)患者的治療有重要指導(dǎo)意義，分離株對(duì)多數(shù)抗菌藥物敏感，對(duì)豬鏈球菌的主要抗菌藥物如青霉素、氨芐西林、頭孢菌素類[1]均敏感?；颊甙此幟糁笇?dǎo)用藥后痊愈出院。四川省48例患者分離的豬鏈球菌2型均對(duì)四環(huán)素耐藥，對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢噻肟、紅霉素、克林霉素等多種抗菌藥物敏感[15]。湖南1例人源豬鏈球菌2型菌株對(duì)四環(huán)素耐藥，對(duì)青霉素G、氨芐西林、紅霉素等多種抗菌藥物敏感[7]。許曉燕等[16]研究表明我國的豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥機(jī)制主要是由tet(M)基因介導(dǎo)的核糖體保護(hù)作用，且tet基因在豬源與人源及其他動(dòng)物源不同種屬細(xì)菌間存在廣泛的交換。此次分離株除對(duì)四環(huán)素耐藥外，還出現(xiàn)了對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥，提示我們新的耐藥情況的發(fā)生。劉荻萩等[17]研究表明er mB基因介導(dǎo)的腺嘌呤甲基化阻斷大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與核糖體結(jié)合是細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的主要耐藥機(jī)制。此次分離株對(duì)紅霉素和克林霉素的新耐藥，可能與獲得er mB基因有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。此次分離株雖然對(duì)目前主要治療用抗菌藥物顯示敏感，但仍應(yīng)引起我們注意，在治療中需要根據(jù)藥敏結(jié)果選擇藥物，避免新的耐藥的發(fā)生，同時(shí)也需關(guān)注獸醫(yī)用藥對(duì)耐藥的影響。

作為豬鏈球菌的種特異性基因(16S r RNA)一直比較穩(wěn)定，在生化和血清學(xué)試劑不全或者診斷不明的情形下，可以更快速有效的鑒定豬鏈球菌的存在，本次分離到的豬鏈球菌14型菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增，16S r RNA結(jié)果為陽性，可以作為豬鏈快速鑒定的檢測方法之一。

本次分離株的毒力基因型為mr p－/sl y＋/f bps＋/ef＋/gdh＋/or f 2＋/gap dh＋。在豬鏈球菌2型菌株的研究中，一般認(rèn)為sl y、mr p及ef 3個(gè)毒力因子可用來區(qū)分高致病、低致病與非致病菌株，sl y、ef、mr p陽性常被認(rèn)為是與菌株的高致病性相關(guān)的[5]。孫珂等[18]對(duì)10株豬源豬鏈球菌4型菌株小鼠致病性試驗(yàn)，ep－、mr p－、sl y－菌株致病性高于ep－、mr p－、sl y＋菌株，證明豬鏈球菌4型與豬鏈球菌2型毒力因子的分布有差異。張振江等[19]研究的1株豬鏈球菌9型菌株，雖然缺失致病性最強(qiáng)的ef、mr p、sl y毒力基因，但在小鼠致病性試驗(yàn)中亦表現(xiàn)很強(qiáng)的致病力，且該菌株還能引起豬的腦膜炎。王淑杰等[20]對(duì)1株豬鏈球菌31型菌株的研究顯示，菌株毒力基因型為gdh＋、mr p－、ef－、sl y－及89PaI－，但小鼠致病性試驗(yàn)呈現(xiàn)明顯的化膿性腦炎現(xiàn)象。綜上所述，我們可以認(rèn)為，與豬鏈球菌2型菌株相比，其他型別的毒力基因分布可能存在差異，部分或全部2型菌株中強(qiáng)毒力基因的缺失并不會(huì)導(dǎo)致其他型別的菌株致病力的降低。mr p是細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，含有mr p的菌株能逃避吞噬細(xì)胞的吞噬，進(jìn)而選擇性地在上皮細(xì)胞中繁殖[21]。在本研究中，患者雖然主要表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，但在隨后的血液培養(yǎng)中同樣檢出豬鏈球菌14型菌株，證實(shí)進(jìn)一步血流感染的存在。因此，此次的14型分離株雖然缺失致病性強(qiáng)的mr p基因，但仍有較強(qiáng)毒性。其致病機(jī)理，有待進(jìn)一步的研究。