吳東興，娜仁格日樂，翟景波，白翠蘭，吳七十三，包桂華

病原體分類學(xué)上蜱傳立克次體病原體大多數(shù)歸屬于立克次體目的立克次體科和無形體科。無形體科的無形體屬(Anaplasma)中主要包括中央無形體(A.centr ale)、牛無形體(A.bovis)、羊無形體(A.capr a)、嗜吞噬細(xì)胞無形體(A.phagocytophil um)。這些無形體均可感染牛、羊等家畜，嗜吞噬細(xì)胞無形體還可感染人的中性粒細(xì)胞引起人粒細(xì)胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)[1]。HGA是1994年在美國首次報道的新發(fā)現(xiàn)人獸共患病[2-3]。蜱是無形體病原體主要傳播媒介[4-8]，牛、綿羊、山羊、狗、馬、人、鹿等動物可以是其宿主[9-12]。近10多年來，國內(nèi)陸續(xù)有無形體感染人病例報道，并于2015年首次報道羊無形體感染人病例[13]。

人經(jīng)攜帶無形體病原體的蜱叮咬后，經(jīng)過1～2周潛伏期發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、身體乏力、頭疼、肌肉酸疼、惡心、嘔吐、腹瀉等[14]。其臨床癥狀有輕有重，很容易誤診為其他發(fā)熱性疾病。內(nèi)蒙古自治區(qū)地域廣闊，對于蜱傳病原體的種類、分布等相關(guān)研究極少。因此，本研究針對蜱傳無形體屬病原體，對通遼地區(qū)綿羊和牛的無形體屬病原體感染狀況進(jìn)行調(diào)查，以便為這些病原體感染的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家畜血液樣本采集 2017－2018年在通遼地區(qū)雙龍泉村(N44°31′27.53″;E120°34′18.95″)、香山鎮(zhèn)(N44°28′56.15″;E120°37′20.43″)、東薩拉嘎查(N44°33′51″;E120°29′57″)、協(xié)代蘇木鎮(zhèn)(N43°52′15.76″;E123°01′34.75″)和珠日河嘎查(N43°51′117.39″;E122°14′30.42″)5個采集點，共對76只綿羊和20頭牛頸靜脈抽血，每只動物的血液樣本放入普通EDTA抗凝管中保存，在管上注明標(biāo)號，放置于4℃帶回實驗室備檢。

1.2 血液DNA提取 采用QIAmap DNA Mini kit(QIAGEN)試劑盒，按照說明書步聚提取血液樣本 DNA，QIAmap○RDNA Mini Kit(Qiagen)、乙醇、50×TAE、Agarose G-10、100 bp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder、2×Taq PCR Master Mix、EB溶液等購于Solar bio有限公司。

1.3 引物合成 根據(jù)國內(nèi)無形體科屬病原體嗜吞噬細(xì)胞無形體(A.phagocytophil um)的特異性16S r RNA基因常規(guī)檢測使用第1輪Eh-out1/Eh-out2引物和第2輪HGA1/HGA2引物是引用于參考文獻(xiàn)[15-16]，新羊無形體(A.capr a)特異性16S r RNA基因引物是引用參考文獻(xiàn)[17]，中央無形體(A.centr al)和牛無形體的特異性16S r RNA基因引物參考文獻(xiàn)[18]。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道的嗜吞噬細(xì)胞無形體、羊無形體、中央無形體、牛無形體的基因擴(kuò)增引物序列(表1)，委托北京六合華大基因科技有限公司合成相關(guān)PCR擴(kuò)增引物。

1.4 PCR擴(kuò)增 嗜吞噬細(xì)胞無形體16S r RNA和羊無形體glt A基因擴(kuò)增使用了巢式PCR方法(nested PCR)，第1輪分別采用了Eh-out1和Ehout2、Aca G-OF1和Aca G-OR1引物，第2輪引物是HGA1和HGA2、Aca G-IF2和Aca G-IR2引物(表1);擴(kuò)增條件為95℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸1 min。中央無形體和牛無形體16S r RNA基因擴(kuò)增使用巢式PCR方法，引物分別為AC1F和AC1R、AB1F和AB2R;擴(kuò)增條件為95℃變性1 min、58℃退火1 min、72℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 4種無形體的目的基因引物Tab.1 Target gene primers of four Anaplasma spp.

2 結(jié) 果

對內(nèi)蒙古通遼地區(qū)農(nóng)家散養(yǎng)的76只綿羊和20頭牛做靜脈采血和采用試劑盒對血樣本提取DNA。使用巢式PCR方法對血液DNA樣本分別進(jìn)行羊無形體的特異性glt A基因及嗜吞噬細(xì)胞無形體、中央無形體和牛無形體的特異性16Sr RNA基因擴(kuò)增。結(jié)果部分綿羊血DNA樣本擴(kuò)增出嗜吞噬細(xì)胞無形體(圖1)和中央無形體的目的基因片段(圖2)。17只扎魯特旗香山鎮(zhèn)綿羊樣本擴(kuò)增出嗜吞噬細(xì)胞無形體目的基因片段，陽性率85.0%(17/20);7只綿羊樣本擴(kuò)增出中央無形體的目的基因片段，陽性率為35.0%(7/20)。雙龍泉村的9只綿羊樣本擴(kuò)增出嗜吞噬細(xì)胞無形體目的基因片段，陽性率為60.0%(9/15);3只綿羊樣本擴(kuò)增出中央無形體目的基因片段，陽性率為20.0%(3/15)。東薩拉嘎查的11只綿羊樣本擴(kuò)增出嗜吞噬細(xì)胞無形體目的基因片段，陽性率為52.4%(11/21);6只綿羊樣本擴(kuò)增出中央無形體目的基因片段，陽性率為28.6%(6/21);珠日河嘎查20只綿羊樣本未能擴(kuò)增到無形體屬病原體16S r RNA和glt A基因片段(表2)。并且，76只綿羊樣本均未擴(kuò)增到新羊無形體glt A基因和牛無形體16Sr RNA基因片段，20頭牛樣本均未擴(kuò)增到4種無形體的目的基因片段。本次研究通遼地區(qū)綿羊的嗜吞噬細(xì)胞無形體總感染率為48.7%(37/76)，中央無形體總感染率為21.1%(16/76)。

圖1 綿羊血DNA樣本中擴(kuò)得的嗜吞噬細(xì)胞無形體16S r RNA基因片段電泳圖Fig.1 Electrophoregram of A.phagocytophilum 16S r RNA gene fragment amplified from sheep blood DNA sample

圖2 綿羊血DNA樣本中擴(kuò)得的中央無形體16Sr RNA基因片段電泳圖Fig.2 Electrophoregram of A.centr ale 16S r RNA gene fragment amplified fromsheep blood DNA sample

表2 通遼地區(qū)綿羊和牛的4種無形體感染率(%)Tab.2 Four Anaplasma spp infection r ates of sheep and cattle in Tongliao area(%)

3 討 論

我國2015年人感染無形體病例首次在Lancet Inf ectious Diseases上報道[17]。2012年國內(nèi)報道了蜱傳播三倉新埃立克體(Candidatus Neoehrlichia mikurensis)感染[19]。除了新發(fā)無形體病外，內(nèi)蒙古地區(qū)還有-布魯菌病等人獸共患病流行[20]。但是，通遼地區(qū)的無形體感染牛、羊未見文獻(xiàn)報道。本研究對通遼地區(qū)家畜動物牛、羊攜帶無形體屬病原體(嗜吞噬細(xì)胞無形體、中央無形體、牛無形體、羊無形體)的感染進(jìn)行調(diào)查研究。首次從通遼市北部山地草原扎魯特旗的綿羊檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體和中央無形體，扎魯特旗處于通遼市西北部，大興安嶺南麓，屬內(nèi)蒙古高原向松遼過渡地帶，也是山地草原散放牧區(qū)，蜱蟲生息的自然條件優(yōu)越地帶。因此，該地區(qū)的牛、羊易被攜帶無形體感染的蜱叮咬而被感染。然而，通遼地區(qū)中南部科爾沁左翼中旗地區(qū)牛、羊均未能檢測到無形體病原體，原因可能是該地區(qū)主要是農(nóng)業(yè)為主，而每年禁牧，牛、羊散放于牧場的時間比較短，從而使牛、羊接觸蜱的機(jī)會少，該平原草地分布蜱蟲的種類不同，其攜帶病原體也不同。

本次研究首次發(fā)現(xiàn)扎魯特旗綿羊攜帶無形體屬嗜吞噬細(xì)胞無形體和中央無形體病原體，并解釋闡明了內(nèi)蒙古通遼地區(qū)潛在的傳染病。因此有必要對該地區(qū)宿主動物攜帶無形體屬病原體、蜱蟲種類，以及這2種無形體對人感染率做進(jìn)一步的調(diào)查研究，為預(yù)警與防控未來突發(fā)傳染病提供科學(xué)依據(jù)。