姚明國(guó)，江佳富，高子厚，賈 娜，湯 麗，何志海，張 青，張 云，王 帆，杜春紅

無形體屬 (Anaplasma spp.)為革蘭染色陰性細(xì)胞內(nèi)專性寄生菌。該菌主要侵染人與動(dòng)物的血細(xì)胞，并以包涵體的形式在宿主細(xì)胞胞漿中繁殖。無形體屬目前包括嗜吞噬細(xì)胞無形體(A.phagocytophilum)、綿羊無形體(A.ovis)、邊緣無形體(A.mar ginale)、血小板無形體(A.pl atys)、牛無形體(A.bovis)、中央無形體(A.centr ale)和山羊無形體(A.capr a)7種[1-2]。已確認(rèn)能感染人的有嗜吞噬細(xì)胞無形體、山羊無形體和綿羊無形體3種[3-5]。人無形體病主要臨床癥狀有發(fā)熱伴白細(xì)胞、血小板減少和多臟器功能損害，治療不及時(shí)可導(dǎo)致死亡[6-7];而嗜吞噬細(xì)胞無形體感染的家畜可出現(xiàn)不規(guī)則發(fā)熱、貧血、體重減輕甚至死亡。綿羊無形體、邊緣無形體和中央無形體主要侵犯反芻動(dòng)物的紅細(xì)胞，受其感染的動(dòng)物可出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸和體重減輕;牛無形體主要感染牛，引起牛無漿體病[8];血小板無形體主要引起犬血小板減少癥[9]。云南西北部地區(qū)地處我國(guó)西南邊陲，與緬甸、老撾和越南3國(guó)交界，由高黎貢山、怒山、云嶺等高大山脈和怒江、瀾滄江、金沙江等江河流域形成的世界著名的“三江并流”縱谷地景觀組成。該地區(qū)大山交匯，垂直高差顯著，立體氣候非常明顯，動(dòng)植物種類異常豐富，復(fù)雜的地形地貌和氣候條件孕育了媒介生物高度多樣性從而形成蟲媒傳染病的高發(fā)區(qū)[10-11]。養(yǎng)殖業(yè)是云南省大部分山區(qū)發(fā)展經(jīng)濟(jì)的主要產(chǎn)業(yè)，且家畜養(yǎng)殖多以放牧為主。既往研究表明，該地區(qū)家畜存在嗜吞噬細(xì)胞無形體、牛無形體等多種無形體感染的情況，但缺乏系統(tǒng)性的調(diào)查研究[12-13]。為了解該地區(qū)家畜無形體感染的情況，本研究采用分子生物學(xué)方法，對(duì)該地區(qū)家畜感染情況進(jìn)行調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 在云南省西北部地區(qū)的15個(gè)縣、市采集家畜血液1 791份，其中牛血555份，羊血630份，犬血556份，馬血33份，驢血17份。采樣區(qū)分布見圖1。用一次性真空采血針和無菌EDTA抗凝管采集家畜靜脈血，編號(hào)后冷藏保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 云南省家畜樣本調(diào)查采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Distribution of domestic sampling area in Yunnan Province

1.2 試劑與設(shè)備 血液基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN Geno mic DNA Kit)、Drea mTaq Green PCR Master Mix(2×)(Ther mo Fisher Scientific)、DL2000 DNA Mar ker、凝膠成像儀(Syngene)、PCR擴(kuò)增儀(SENSO，Lab Cycler Gradient Fuses型)、水平電泳槽(JY-SPFT型)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 DNA提取 取200μL抗凝血液，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.2 PCR基因擴(kuò)增 采用半巢式PCR方法擴(kuò)增無形體16S r RNA基因660 bp片段。引物為Ehout1(5′-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3′)、3-17pan (5′-TAAGGTGGTAATCCAGC-3′)和 Eh-out2(5′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3′)[14]。

反應(yīng)條件:第一輪擴(kuò)增(Eh-out1/3-17pan，1 500 bp):預(yù)變性95℃、3 min，變性95℃、30 s，退火55℃、40 s，延伸72 ℃、45 s，終延伸72℃、7 min。第二輪(Eh-out1/Eh-out2，660bp):預(yù)變性95℃、3 min，變性95℃、30 s，退火57℃、40 s，延伸72℃、45 s，終延伸72℃、1 min。均為35個(gè)循環(huán)。

1.3.3 序列測(cè)定與分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳成像，將出現(xiàn)約660 bp條帶的PCR產(chǎn)物送上海(生工)生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用Seq Man軟件將所得序列進(jìn)行拼接。登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點(diǎn)，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具將測(cè)序結(jié)果與Gen Bank中注冊(cè)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，進(jìn)行無形體種的確定。應(yīng)用MEGA6.06軟件，鄰接法N-J構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將調(diào)查數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理后，運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增共檢出陽性條帶586份，經(jīng)測(cè)序成功并序列比對(duì)為無形體的樣本共503份，另外83份主要為測(cè)序失敗28份、埃立克體36份、非特異擴(kuò)增雜菌19份。部分樣本電泳結(jié)果見圖2。

圖2 部分家畜樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Results of PCR amplified products electrophoresis in some blood samples

2.2 不同地區(qū)不同家畜無形體檢測(cè)結(jié)果 PCR擴(kuò)增共檢出陽性條帶586份，經(jīng)測(cè)序成功并序列比對(duì)為無形體的樣本共503份，其中牛、羊和犬的陽性率分別為 41.08%(228/555)、38.10%(240/630)和6.29%(35/556)，馬和驢中均未檢出任何無形體(表1)。測(cè)定擴(kuò)增陽性片段的DNA序列，將獲得序列做同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中73株序列(14.51%)屬嗜吞噬細(xì)胞無形體，226株序列(44.93%)屬綿羊無形體，137株序列(27.24%)屬邊緣無形體，48株序列(9.54%)屬血小板無形體，16株序列(3.18%)屬牛無形體，3株序列(0.60%)屬山羊無形體。其中牛樣本檢出6種無形體，以邊緣無形體為主(75/228);羊樣本檢出5種無形體，以綿羊無形體為主(216/240)，但未檢測(cè)到山羊無形體;犬血僅檢出嗜吞噬細(xì)胞無形體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不同家畜樣本檢出無形體基因的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，陽性率最高的是牛、其次是羊，犬最低，馬和驢未檢測(cè)到。15個(gè)縣市中有12個(gè)縣市的家畜樣本檢出無形體基因，主要分布在德欽縣、香格里拉縣、盈江縣、騰沖市等縣市，德欽縣、香格里拉縣和騰沖市檢出的無形體種類最為豐富(表1、表2)。以盈江縣的牛的樣本陽性率最高(95.65%)，牛以邊緣無形體為主。

表1 云南西北部地區(qū)家畜血液樣本的無形體PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Sample infor mation and test result

表1 (續(xù))

表2 不同地區(qū)家畜血液樣本無形體PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Result of Anaplasms in domestic in different area 單位:(頭)

2.3 檢出的無形體序列分析 將PCR擴(kuò)增出16Sr RNA基因序列分別與Gen Bank中注冊(cè)的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，其分別與6種無形體16Sr RNA基因序列的同源性＞98%，以立氏立克次體(Rickettsia rickettsii，DQ150682.1)16Sr RNA基因序列為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。不同地區(qū)檢出的嗜吞噬細(xì)胞無形體16Sr RNA基因序列的同源性在96.8%～100%，種間差異較大分為幾個(gè)小分枝。在香格里拉綿羊和黃牛檢出的基因序列(TCB-7、TC-B-188)與韓國(guó)人血分離到的嗜吞噬細(xì)胞無形體菌株16Sr RNA基因序列(MH482862.1)的同源性為99.77%，僅有2個(gè)堿基的差異。從香格里拉和德欽的牦?；螯S牛樣本中檢出3株山羊無形體基因序列的同源性＞98.8%，但卻分別處相鄰小分枝。其中DQ-B-15與中國(guó)浙江蜱檢出的中國(guó)株16S r RNA基因序列(KR261020.1)的同源性為99%，與中國(guó)黑龍江省患者血液分離株16Sr RNA基因序列(K M206275)的同源性為98.25%。羊和黃牛樣本中檢出48株血小板無形體序列，其同源性為97.9%～100%，其中YJ-B-80與哥斯達(dá)黎加株(KY389143.1)、菲律賓株(JQ8947792.2)和中國(guó)株(KU586031.1)的16S r RNA基因序列100%同源。在牛、羊中檢出16株牛無形體16Sr RNA基因序列的同源性為97.6%～99.8%，與湖北山羊株、韓國(guó)蜱株聚在同一分枝，HP-B-3與俄羅斯株(KC484563.1)16Sr RNA基因序列完全一致。檢出的所有邊緣無形體16S r RNA基因序列的同源性為98%～100%，與南非、菲律賓等地的羊和蜱株聚為一群。

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明，云南省西北部地區(qū)家畜樣本中檢測(cè)到的無形體分布在6個(gè)無形體種群中，包括嗜吞噬細(xì)胞無形體、綿羊無形體、邊緣無形體、血小板無形體、牛無形體、山羊無形體。但TCB-6、YJ-B-76株不能與同源性較高的同種無形體聚在同一個(gè)分枝(圖3)。

圖3 基于無形體16Sr RNA基因660 bp片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 660 bp fragment of 16Sr RNA gene

3 討 論

本研究以云南省西北部地區(qū)的牛、羊、犬、馬和驢為主要調(diào)查對(duì)象，應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，了解這些與人類密切接觸的家畜感染無形體病的情況，為家畜無形體病的防治提供參考，為人感染無形體病的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。調(diào)查共在15個(gè)縣(市)采集1 791份血樣，以當(dāng)?shù)丶彝ヰB(yǎng)殖的主要?jiǎng)游锱?、羊、犬為主，共檢出503頭/只動(dòng)物感染了6種無形體，牛、羊和犬的感染率分別為41.08%、37.97%、6.29%。在采集到羊血樣本的11個(gè)縣(市)，除盈江縣外均存在自然感染，而盈江縣可能因樣本量太小(僅5份)有關(guān)，羊共感染了除山羊無形體外的5種無形體，以綿羊無形體為主。在6個(gè)縣(市)采集了牛血樣本，全部縣市均存在自然感染無形體的情況，種類達(dá)6種;5個(gè)縣(市)采集的犬血樣本僅德欽縣的犬存在感染嗜吞噬細(xì)胞無形體。其中盈江、華坪、云龍等縣家畜檢出無形體的陽性率較高，如盈江縣的牛檢出率高達(dá)96.56%，而香格里拉、騰沖和德欽等縣市檢出無形體的種類最多。尤其是對(duì)人致病的嗜吞噬細(xì)胞無形體和山羊無形體主要分布在滇西北的德欽、香格里拉、騰沖地區(qū)。通過16S r RNA基因序列分析，牛、羊、犬檢出的嗜吞噬細(xì)胞無形體16S r RNA基因序列同源性為97.5%～100%，在香格里拉綿羊、黃牛和犬樣本中檢出的基因序列與從韓國(guó)人血分離到的菌株的16Sr RNA基因序列(MH482862.1)同源性高達(dá)99.77%。嗜吞噬細(xì)胞無形體可以感染人，引起人粒細(xì)胞無形體病(HGA)，硬蜱、血蜱、扇頭蜱等多種蜱類可作為傳播媒介，主要宿主為野生哺乳動(dòng)物，包括美洲野牛、白尾鹿、狼、牛、羊、犬、馬和兔等[14]。1994年美國(guó)報(bào)道了首例HGA病例，之后相繼在北美洲、澳洲、歐洲、亞洲等地發(fā)現(xiàn)HGA，且感染人數(shù)和確診病例呈逐年上升的趨勢(shì)[15-16]。2006年我國(guó)報(bào)道首例實(shí)驗(yàn)室確診HGA病例[14]，此后在山東、浙江、江蘇、黑龍江、新疆等地先后檢測(cè)到嗜吞噬細(xì)胞無形體核酸和/或抗體[17-19]。而山羊無形體是我國(guó)學(xué)者于2015年發(fā)現(xiàn)的人獸共患新病原體[5]。本次在德欽和香格里拉的牛樣本中檢出相應(yīng)基因片段，兩地牛血中檢出的序列同源性為98.7%，其序列與中國(guó)黑龍江省患者血液分離的山羊無形體16S r RNA基因序列(K M206275)的同源性為98.25%，牛存在山羊無形體感染的情況值得關(guān)注。同時(shí)，本次調(diào)查在3份羊血中檢出牛無形體、10份牛血中檢出綿羊無形體的情況，一般認(rèn)為牛無形體是感染牛、綿羊無形體感染羊，該結(jié)果需作進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證。

云南省西北部地區(qū)是我國(guó)生物多樣性較高的地區(qū)之一，動(dòng)植物物種極為豐富。尤其近年來隨著天然林保護(hù)工程的實(shí)施，森林植被逐漸恢復(fù)，野生動(dòng)物也隨之增加。在經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后的山區(qū)，發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)成為山區(qū)群眾脫貧的一種重要的方式。由于自然資源優(yōu)良，牛、羊多進(jìn)行放養(yǎng)，在滇西北高原還進(jìn)行冬季和夏季牧場(chǎng)交替放牧的情況，家犬隨主人和牧群轉(zhuǎn)場(chǎng)，活動(dòng)范圍更廣。而云南是我國(guó)蜱種最豐富的地區(qū)，據(jù)報(bào)道蜱種達(dá)46種之多[20]。野外放牧使得一些在野生動(dòng)物體表寄生的蜱，寄生到家畜和家犬，同時(shí)進(jìn)行疾病的傳播，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來危害。本次從30頭牛、8頭羊、35只犬樣本中檢出嗜吞噬細(xì)胞無形體、3頭牛中檢出山羊無形體，且基因序列相互同源性較高，與對(duì)人致病株的同源性也高，提示滇西北地區(qū)可能存在該疾病自然疫源地，犬感染傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)更大，下一步需加強(qiáng)當(dāng)?shù)厝巳汉万缦x感染狀況調(diào)查。同時(shí)，其它無形體感染，在不同程度上也會(huì)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來危害，影響家畜繁殖、肉質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，在發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)的同時(shí)，需開展健康教育宣傳工作，提高個(gè)人的防護(hù)意識(shí)，避免被蜱蟲叮咬，加強(qiáng)家養(yǎng)動(dòng)物的管理，如定期對(duì)動(dòng)物圈舍、動(dòng)物體表滅蜱等寄生蟲，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)保障人、畜健康。