李璽 肖強(qiáng) 張倩 梁烙琪 盧燕珊 陳明真 歐陽(yáng)雁弟 榮福

南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院(佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科528308

我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家,僅次于印度,居全球第2位［1］。結(jié)核病的主要類(lèi)型之一結(jié)核性胸膜炎是發(fā)展中國(guó)家最常見(jiàn)的胸腔積液病因［2］,也是不明原因胸腔積液的主要病因之一［3］。造成結(jié)核性胸膜炎診斷困難的主要原因是目前的診斷方法敏感性低,胸水涂片找抗酸桿菌的敏感性只有6%,胸水培養(yǎng)結(jié)核桿菌的敏感性?xún)H為36.3%［4］,Xpert MTB/RIF診斷結(jié)核性胸膜炎的總體敏感性為30%［5］,上述方法對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值有限;而診斷率高的內(nèi)科胸腔鏡檢查屬于有創(chuàng)操作,由于技術(shù)和條件的限制并沒(méi)有廣泛開(kāi)展。臨床最常用的診斷結(jié)核性胸膜炎的生物標(biāo)志物為腺苷脫氨酶,以腺苷脫氨酶≥45 U/L 作為診斷標(biāo)準(zhǔn),其敏感性?xún)H為36.7%［6］,且腺苷脫氨酶的水平還受年齡的影響［7］。準(zhǔn)確診斷對(duì)于控制結(jié)核病很重要,但2019年全球結(jié)核報(bào)告指出在結(jié)核診斷技術(shù)方面目前還沒(méi)有什么新的突破［1］,因此提高結(jié)核性胸膜炎的診斷水平需尋求新的方法和手段。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)具有獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu),具有高度穩(wěn)定性、組織豐富性和疾病特異性等特點(diǎn)［8］,在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯調(diào)控中起著潛在作用,這使得circRNA 作為新型臨床診斷標(biāo)志物成為可能。本研究分析結(jié)核性胸膜炎與非結(jié)核非腫瘤患者胸膜組織中的circ RNA 表達(dá)譜變化,分析兩者的差異并預(yù)測(cè)其相關(guān)靶基因,初步探索circRNA與結(jié)核性胸膜炎的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年3-11月在南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院(佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院)住院的經(jīng)內(nèi)科胸腔鏡胸膜活檢,病理確診為結(jié)核性胸膜炎患者13例為實(shí)驗(yàn)組;13例對(duì)照組標(biāo)本來(lái)自經(jīng)病理確診為肺部慢性炎性結(jié)節(jié)或支氣管擴(kuò)張癥患者在行胸腔鏡檢查時(shí)留取的正常胸膜組織。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡＞18歲,既往無(wú)結(jié)核或腫瘤病史,未行診斷性抗結(jié)核治療,常規(guī)胸穿抽液送檢未能明確胸腔積液病因,簽署知情同意書(shū)后行胸腔鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):妊娠或哺乳期婦女,既往有結(jié)核或腫瘤病史,曾行診斷性抗結(jié)核治療,患有其他嚴(yán)重疾病者,不能耐受內(nèi)科胸腔鏡檢查者,未簽署知情同意書(shū)者。標(biāo)本-80 ℃凍存。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別隨機(jī)選取3份標(biāo)本行高通量測(cè)序,其余10份標(biāo)本行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)驗(yàn)證。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 (1)RNA 樣品抽取:采用Magen Hipure Total RNA Mini Kit并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)3例胸膜轉(zhuǎn)移癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行總RNA 的抽提,抽提所得的總RNA取樣質(zhì)檢。(2)RNA 樣品質(zhì)檢方法:瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 降解程度,判斷是否有基因組污染;Qubit 3.0檢測(cè)RNA 樣品濃度;Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA 的完整性。 (3)文庫(kù)構(gòu)建:樣品質(zhì)檢合格后,使用Total RNA-seq Library Prep Kit for Illumina?構(gòu)建文庫(kù),先將設(shè)計(jì)好的DNA 探針與RNA 樣品進(jìn)行雜交,從而將r RNA從總RNA 中去除;隨后將RNA 進(jìn)行片段化,合成cDNA 第一鏈,采用鏈特異的方法,在第二鏈cDNA 合成時(shí)摻入d UTP 對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記,同時(shí)在此步完成了末端修復(fù);接著進(jìn)行加A-尾、連接接頭、連接產(chǎn)物純化和片段大小分選、文庫(kù)擴(kuò)增等步驟,在PCR 擴(kuò)增前用UDG 酶消化帶d UTP 第二鏈模板,擴(kuò)增結(jié)束后用磁珠純化回收即得RNASeq文庫(kù)。 (4)文庫(kù)質(zhì)控:先使用Qubit 3.0進(jìn)行初步定量,隨后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)大小范圍進(jìn)行檢測(cè),插入的目的片段大小符合預(yù)期后,使用qPCR 方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度＞3 nmol/L),以保證文庫(kù)質(zhì)量。(5)上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 差異表達(dá)的circRNA 進(jìn)行q RT-PCR 驗(yàn)證 用edgeR 對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了circ RNA差異表達(dá)分析(差異倍數(shù)＞1.5,P＜0.05),從篩選出的差異circ RNA 中選擇6 個(gè)circRNA 進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。引物序列見(jiàn)表1。按TRIzol?試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cRNA,反應(yīng)條件為25℃10 min,42℃15 min,85 ℃5 min;采用SYBR Green法qRTPCR 驗(yàn)證,反應(yīng)條件為95 ℃5 min,95 ℃10 s,60 ℃34 s,40個(gè)循環(huán),擴(kuò)增結(jié)束后按95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s建立溶解曲線。GAPDH 基因作為內(nèi)參基因,根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算目標(biāo)基因表達(dá)情況。

表1 引物序列

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用miRanda軟件,根據(jù)比對(duì)得分＞150、自由能＜-20,預(yù)測(cè)差異表達(dá)circ RNA 的微小RNA (micro RNA,miRNA)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0 for Windows軟件對(duì)2-ΔΔCt值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),以x-±s表示,2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果 篩選實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的胸膜組織的circRNA 表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)存在差異表達(dá)的circ RNA 有134個(gè),其中53個(gè)表達(dá)上調(diào),81個(gè)表達(dá)下調(diào),部分結(jié)果見(jiàn)表2。差異倍數(shù)＞1.5,P＜0.05。根據(jù)差異表達(dá)分析結(jié)果繪制火山圖和熱圖(圖1、2)。

表2 高通量測(cè)序篩查表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的部分環(huán)狀RNA

圖1 環(huán)狀RNA 火山圖

圖2 差異表達(dá)環(huán)狀RNA 熱圖

2.2 miRNA-circRNA 關(guān)系預(yù)測(cè) 利用miRanda軟件,根據(jù)比對(duì)得分＞150,自由能＜-20 得到miRNA-circ RNA 關(guān) 系,circRNA 序 列 上 的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目越多,那么miRNA 就更有可能結(jié)合到circRNA 上。因此,對(duì)miRanda結(jié)果進(jìn)行了過(guò)濾,保留了結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目≥2的miRNAcircRNA 關(guān)系,繪制了miRNA-circRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。

圖3 miRNA-circ RNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 差異表達(dá)的circ RNA 的qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果篩選處理得到差異表達(dá)的circ RNA 中挑選3個(gè)顯著上調(diào)的circ RNA hsa_circ_0008433、hsa_circ_0009142、hsa_circ_00033144和3個(gè)顯著下調(diào)的circ RNA hsa_circ_0008234、hsa_circ_007342、hsa_circ_0001368

進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組hsa_circ_0008433的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組hsa_circ_0008234、hsa_circ_0001368的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05),結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致。其余3個(gè)circRNA 的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4～6。

圖4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組hsa_circ_0008433差異表達(dá)的散點(diǎn)圖

2.4 差異表達(dá)的circ RNA 的靶基因預(yù)測(cè) 利用miRanda軟件,分別預(yù)測(cè)hsa_circ_0008433、hsa_circ_0008234、hsa_circ_0001368 的可能相互作用的miRNA,列出每一個(gè)circ RNA 的前面5個(gè)miRNA。見(jiàn)表3。

圖5 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組hsa_circ_0008234差異表達(dá)的散點(diǎn)圖

圖6 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組hsa_circ_0001368差異表達(dá)的散點(diǎn)圖

3 討論

44 年 前 circRNA 在 RNA 病 毒 中 被Kolakofsky發(fā)現(xiàn)［9］,當(dāng)時(shí)并沒(méi)有被重視。近年來(lái),隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展,大量的circRNA 被發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)執(zhí)行多種重要的生物學(xué)功能［10］。circRNA呈環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu),擁有高度保守性、穩(wěn)定性和細(xì)胞特異性［11］,表明circRNA 可作為潛在的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)［12］。迄今為止,已有多項(xiàng)研究表明circRNA 與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。孫暢等［13］研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)核病外周血中has_circ_0090508的表達(dá)量顯著下降。黃自坤等［14］研究認(rèn)為血漿hsa_circ_0009024有望作為肺結(jié)核診斷的潛在生物標(biāo)志物。Qian等［15］研究認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞7個(gè)circRNA 可以作為活動(dòng)性肺結(jié)核的潛在診斷標(biāo)志物。

本研究從結(jié)核性胸膜炎組織篩選出差異表達(dá)的circRNA有134個(gè),其中53個(gè)表達(dá)上調(diào),81個(gè)表達(dá)下調(diào)。circ RNA 表達(dá)譜的變化提示circ RNA 參與了結(jié)核性胸膜炎發(fā)病機(jī)制的調(diào)控,表明circRNA可能是結(jié)核性胸膜炎的潛在且獨(dú)特的生物標(biāo)志物。為進(jìn)一步確認(rèn)circRNA 在結(jié)核性胸膜炎組織和正常胸膜組織的表達(dá)差異,筆者從差異倍數(shù)＞1.5的存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因中選擇了3個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。結(jié)果顯示,hsa_circ_0008433在結(jié)核性胸膜炎組織的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,hsa _ circ _ 0008234、hsa_circ_0001368在結(jié)核性胸膜炎組織的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組,結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致。qRT-PCR 驗(yàn)證了高通量測(cè)序的結(jié)果,為進(jìn)一步深入研究提供了方向,有可能篩選出在結(jié)核性胸膜炎發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用的circRNA。但本研究存在不足之處,本研究為結(jié)核性胸膜炎circRNA表達(dá)譜的初步分析研究,腫瘤性胸膜轉(zhuǎn)移是否出現(xiàn)類(lèi)似的改變尚未可知,需進(jìn)一步研究明確。

表3 可能與circRNA 相互作用的miRNA

miRNA 是短鏈非編碼RNA,越來(lái)越多的研究表明,circRNA 能夠與miRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,從而影響miRNA 及下游靶基因的表達(dá)［16］。本研究對(duì)差異表達(dá)的hsa_circ_0008433、hsa_circ_0008234、hsa_circ_0001368 進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0008234可能與hsa-miR-17、hsa-miR-20b-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-320b 等miRNA 相互作用。朱恩東［17］研究表明,miR-20b在體外可以抑制Th17細(xì)胞的分化,并且這種抑制作用不依賴(lài)Th17細(xì)胞的增殖或凋亡;在體內(nèi)可能通過(guò)抑制靶基因STAT3和RORγt表達(dá)抑制Th17細(xì)胞的分化生成。人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答主要依賴(lài)于T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫,筆者推測(cè)hsa_circ_0008234 表達(dá)的下調(diào)可能導(dǎo)致對(duì)miR-20b負(fù)調(diào)控減弱,miR-20b抑制了Th17 細(xì)胞的分化生成,可能更容易發(fā)生結(jié)核性胸膜炎。人體在抗結(jié)核菌感染的過(guò)程中主要依靠細(xì)胞免疫;自噬溶酶體吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌是人體清除結(jié)核分枝桿菌的重要方式之一。張益源等［18］研究發(fā)現(xiàn),感染結(jié)核分枝桿菌后有多種miRNA 包括miR-17-5p和miR-20a-5p等上調(diào),這些miRNA 可導(dǎo)致自噬基因的m RNA 降解,進(jìn)而影響自噬溶酶體的生成,使得結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)避免被清除,最終存活下來(lái)［19-20］。hsa_circ_0008234有多個(gè)miRNA 結(jié)合位點(diǎn),可以像海綿般吸附miRNA,hsa_circ_0008234 的表達(dá)下調(diào)可能會(huì)對(duì)上述miRNA 的抑制作用減弱,導(dǎo)致Th細(xì)胞分化和自噬作用受影響,進(jìn)而削弱機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞免疫功能,引起結(jié)核性胸膜炎的發(fā)生發(fā)展,這對(duì)結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病機(jī)制提出了一個(gè)新的方向,但還需要下一步的研究驗(yàn)證。

綜上所述,結(jié)核性胸膜炎患者胸膜組織中circRNA 表達(dá)譜發(fā)生了變化,這些差異表達(dá)的circRNA 可能參與了結(jié)核性胸膜炎發(fā)生發(fā)展的調(diào)控,hsa_circ_0008433、hsa_circ_0008234 和hsa_circ_0001368有望成為結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突