齊小浪 杜娟 李尚偉

摘?要：九香蟲Coridius chinensis是一種藥食兩用的資源昆蟲，溶菌酶是一種能水解細(xì)菌中黏多糖的胞壁質(zhì)酶。本研究克隆了一種九香蟲溶菌酶基因CcLys2，其cDNA長1096 bp，包含一個長672 bp的開放閱讀框，編碼223個氨基酸（aa）。九香蟲溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa組成的信號肽，成熟CcLys2是一種分子量為23.34 kDa的分泌型親水蛋白。成熟CcLys2形成7個α-螺旋和2個β-折疊片的三維分子結(jié)構(gòu)，并由4個二硫鍵穩(wěn)定其構(gòu)象。同源性和聚類分析表明，CcLys2與來自斯氏珀蝽Plautia stali的C-型溶菌酶的親緣關(guān)系最近。生物信息學(xué)分析結(jié)顯示，CcLys2很可能屬于具有消化作用的C-型溶菌酶。本研究為今后進一步闡明CcLys2基因的功能及開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：九香蟲;溶菌酶;基因克隆;特征分析

中圖分類號：R282文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2020）03-0011-06?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.002

Gene Cloning and Bioinformatics Analysis of Lysozyme CcLys2 from Coridius chinensis

QI Xiaolang， DU Juan， LI Shangwei.*

（Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Regions， Institute of Entomology， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：Coridius chinensi is an important resource insect as medicine and food. Lysozyme， also known as muramidase or N-acetylmuramide glycanhydrolase， can hydrolyze mucopolysaccharide in bacteria. In this study， a lysozyme gene， named CcLys2，was cloned from C. chinensis. The cDNA of CcLys2 is 1，096 bp in length and contains an open reading frame （ORF） of 672 bp that encodes 223 amino acids （aa）. The CcLys2 zymoprotein contains a signal peptide composed of 13 aa at N-terminus. The mature CcLys2 is a secretory hydrophilic protein with a molecular weight of 23.34 kDa， and forms a three-dimensional molecular structure of 7 α-helixes and 2 β-pleated sheets with 4 disulfide bonds to stabilize the conformation. Homology and cluster analyses show CcLys2 possesss the closest relationship with C-type lysozyme from Plautia stali. Bioinformatics analysis show that CcLys2 probably belongs to digestive C-type lysozyme. This study lays a foundation for further elucidating the function of the CcLys2 gene and developing new antimicrobials in the future.

Keywords：Coridius chinensis; lysozyme; gene cloning; characteristic analysis

多細(xì)胞生物常遇到病原生物的侵染，盡管昆蟲缺乏經(jīng)典意義上的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，但它們也擁有強大的抗感染手段，如吞噬細(xì)菌和包裹寄生蟲的能力，這些反應(yīng)包括激活胞外蛋白酶級聯(lián)、黑化反應(yīng)及誘導(dǎo)抗菌肽基因表達(dá)[1]。溶菌酶（lysozyme）是先天免疫的重要成員之一，作為一種N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，其在生物作用上因種類差異主要有抗菌防御及消化酶的功能[2]。C-型溶菌酶（1，4-β-N-乙酰胞壁酰胺酶）是一種分泌型溶菌酶，多分布于節(jié)肢動物、魚類、鳥類及哺乳動物體內(nèi)，是至今所有溶菌酶中研究得最為廣泛和深入的一類酶. [3]。肽聚糖和殼聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，而β-1，4-糖苷鍵是穩(wěn)定肽聚糖和殼聚糖的重要結(jié)構(gòu)，C-型溶菌酶通過特異性裂解β-1，4-糖苷鍵，破壞病原菌細(xì)胞壁而具有溶菌活性，保守的天光氨酸和谷氨酸是發(fā)揮C型溶菌酶溶菌活性所必需的功能結(jié)構(gòu)位點. [4-5]。

九香蟲Coridius chinensis是一種以葫蘆科植物汁液為食的半翅目兜蝽科昆蟲，主要分布于我國的沿海、中部及西南地區(qū)[6]。九香蟲是一種藥食兩用昆蟲，臨床上具有理氣止痛、溫中助陽等藥用功效。該蟲味道及營養(yǎng)價值俱佳，可作為一種保健食品，貴州道真等地都有食用九香蟲的習(xí)慣，是臨床上和保健食品中具有極大開發(fā)利用價值的資源昆蟲[7-8]。九香蟲具有較強的免疫防護能力，其在野外被外源異物侵染死亡的情況較為罕見，提示九香蟲有著較為完善的免疫系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，九香蟲血淋巴中的某些蛋白對細(xì)菌和癌細(xì)胞都具有抑制或殺傷作用，吳瑪莉[9]等從九香蟲血淋巴中提取的多肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制效果;李尚偉等[10]通過質(zhì)譜法從九香蟲血淋巴分離得到的CcAMP1對G.+及G.-均具有明顯的抑菌作用;九香蟲血淋巴能顯著抑制胃癌細(xì)胞 SGC-7901生長，通過進一步提純發(fā)現(xiàn)該蟲血淋巴的蛋白提取物對SGC-7901亦具有顯著的生長抑制活性[11-12]。目前C-型溶菌酶的研究主要集中在脊椎動物及蠅類中，而半翅目昆蟲C-型溶菌酶的研究相對較少。該研究從九香蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出一種溶菌酶基因命名為CcLys2，利用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR， RT-PCR）克隆驗證了該基因的序列，并用生物信息學(xué)軟件和方法對其進行生物信息學(xué)分析。該研究為C-型溶菌酶家族再添加一個新成員，為進一步研究CcLys2基因的功能及九香蟲資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料來源

九香蟲成蟲采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)，以人工種植的南瓜桿莖飼喂于人工氣候箱內(nèi)，飼養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，濕度（68±5%），光周期14L：10D。

1.2?總RNA提取及第一鏈cDNA制備

根據(jù)HP Total RNA Kit（Omega Bio-Tek， GA， USA）說明書提取九香蟲總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計（Thermo Fisher， MA， USA）檢測其純度和濃度，檢測合格的RNA于-80℃保存?zhèn)溆?。第一鏈cDNA的制備根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher， MA， USA）說明書進行操作，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?CcLys2基因克隆

基于從九香蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出的一條溶菌酶基因的部分序列，用NCBI的Primer-BLAST設(shè)計特異性引物（CL-F： ATGTTGCTGCTCTTCCTCCT; CL-R： CTGACTGACCACACCAAGATTC），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。在T100 PCR儀（Bio-Rad， CA， USA）上進行目的基因擴增，反應(yīng)體系為50μL： 25μL2×TsingKe Master Mix（北京擎科生物公司），2μL cDNA模板，上/下游引物（10 μM）各1μL，補加21μL滅菌超純水。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸40s， 30個循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收純化目的基因，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取重組子進行菌落PCR鑒定，送陽性克隆至生工生物工程（上海）有限公司進行測序，將所測序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中溶菌酶基因序列進行比對驗證。

1.4?生物信息學(xué)分析

CcLys2基因的編碼區(qū)用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進行預(yù)測，采用SignalP 5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽，用ProtParam （https：//web.expasy.org/protparam/） 對酶蛋白進行分子量和等電點預(yù)測。用NetOGlyc 4.0Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/） 和NetNGlyc 1.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測糖基化位，DiANNA 1.1web server（http：//clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/）預(yù)測二硫鍵，KinasePhos（http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/）預(yù)測磷酸化位點，PSORT II Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測亞細(xì)胞定位。用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro）分析酶蛋白的結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN 9（Lynnon Biosoft， CA， USA）將CcLys2氨基酸序列與其他13種昆蟲溶菌酶氨基酸序列進行比對，并用MEGA X構(gòu)建溶菌酶的鄰接樹（NJ法），重復(fù)運行1000次，節(jié)點上的數(shù)值表示自舉檢驗值。表2為氨基酸序列比對和構(gòu)建進化樹的溶菌酶來源物種及相應(yīng)的GenBank登錄號。用PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）預(yù)測成熟CcLys2的二級結(jié)構(gòu)，使用 SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/）的同源建模方法預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL2.3（Schrodinger， New York， USA）繪制其分子結(jié)構(gòu)圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?CcLys2的cDNA克隆

九香蟲總RNA電泳圖顯示清晰的28S和18S兩條帶（圖1-A），紫外分光光度計檢測顯示其A260/A280比值為1.90，故提取的總RNA濃度及純度較好，能滿足后續(xù)的實驗要求。RT-PCR擴增九香蟲溶菌酶CcLys2基因的cDNA序列，得到單一明亮且符合預(yù)期大小的條帶，測序驗證其長度為1096bp（圖1-B）。CcLys2基因的cDNA長度為1096bp（GenBank登錄號：MN816376），包含一個長672bp的開放閱讀框，編碼223個氨基酸（aa），3′端非編碼區(qū)為424bp，具有典型的加尾信號AATAAA（圖2）。

2.1?CcLys2特征分析

九香蟲溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa組成的信號肽，成熟蛋白由210 aa組成。理

A：九香蟲總RNA;B： CcLys2基因擴增。

M： DL2000 DNA marker; 1：CcLys2基因;圖1?九香蟲溶菌酶CcLys2擴增電泳圖Fig.1?Electropherogram of the CcLys2 gene amplification

化性質(zhì)分析表明，成熟CcLys2的分子式為C1013H1566N282O331S11，分子量為23.34 kDa，理論等電點pI為5.20;含有30個負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp和Glu），25個正電荷氨基酸殘基（Arg和Lys）。親水性平均系數(shù)為-0.56，不穩(wěn)定指數(shù)為24.32，這表明成熟CcLys2為穩(wěn)定的親水蛋白。成熟CcLys2具有2個N-糖基化位點（N36， N135）和17個O-糖基化位點，6個磷酸化位點（S82， S132， S134， S151， S198， Y120）。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，CcLys2為分泌蛋白，分布在細(xì)胞外基質(zhì)的概率為77.8%，而分布在細(xì)胞質(zhì)及線粒體的概率分別為11.1%。

結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，成熟CcLys2具有糖苷水解酶22家族（Glycoside hydrolase family 22， GH22）中C-型溶菌酶亞家族的保守位點與結(jié)構(gòu)催化域，屬于GH22家族成員。GH22家族包括C-型溶菌酶和α-乳清蛋白，這兩類蛋白約有35-40%的氨基酸及4個二硫鍵的位置是保守的，但其功能完全不同。同源建模預(yù)測結(jié)果顯示，成熟CcLys2中1-126 aa形成7個α-螺旋，2個β-折疊片及10個無規(guī)卷曲，并用4個二硫鍵（C6-C124， C27-C113， C62-C73， C69-C87）穩(wěn)定其構(gòu)象（圖3）。

2.3?同源性分析與聚類樹

將CcLys2的氨基酸序列在NCBI的Nr蛋白數(shù)據(jù)庫里用BlastP進行在線比對，結(jié)果表明CcLys2與源自斯氏珀蝽P. stali的C-型溶菌酶氨基酸序

列有著較高的同源性，相似度為65.45%。將CcLys2同13個來源于其他昆蟲的溶菌酶氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)，組成不同溶菌酶的氨基酸殘基數(shù)有137-228個不等，但均具有保守的8個半胱氨酸位點及催化活性位點E32和D50，這是維持溶菌酶結(jié)構(gòu)和功能所必需的結(jié)構(gòu)（圖4）。系統(tǒng)進化樹顯示，CcLys2與茶翅蝽溶菌酶及斯氏珀蝽溶菌酶聚為一支，再與溫帶臭蟲溶菌酶聚為一支（圖5）。同源性與聚類分析結(jié)果表明，CcLys2與來自斯氏珀蝽的C-型溶菌酶具有最近的親緣關(guān)系。

3?結(jié)論與討論

作為動物體內(nèi)抵御病原菌的關(guān)鍵抗菌物質(zhì)，C-型溶菌酶基因大多表達(dá)于動物的免疫組織和細(xì)胞中，昆蟲C-型溶菌酶主要在血淋巴和脂肪體中表達(dá)[7]，在昆蟲抵抗外源病菌的過程中扮演著重要

角色。通常具有抗菌作用的溶菌酶皆為堿性蛋白，等電點偏高，而具有消化作用的溶菌酶與此相反，其最適pH范圍較窄，等電點僅在5左右，并且對胃蛋白酶不敏感。消化型的C-型溶菌酶在昆蟲腸道中能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)的內(nèi)容物，幫助宿主吸收有用的成分以滿足本身對營養(yǎng)物質(zhì)及能量的需求。來源于黑腹果蠅Drosophila melanogaster的6種C-型溶菌酶，僅LysP為堿性蛋白，而LysB， LysC， LysD， LysE和LysS皆為酸性蛋白，且在腸道中高表達(dá)[13]。在本研究中，九香蟲溶菌酶CcLys2的等電點為5.2，具有同其他消化型溶菌酶一樣的等電點，推測其可能屬于消化性溶菌酶，其功能還需要進一步研究。

已報道的C-型溶菌酶具有典型的結(jié)構(gòu)特征，如8個保守的半胱氨酸殘基形成4個二硫鍵，這是維持溶菌酶高級結(jié)構(gòu)及酶活所必需的共價鍵;同時4個二硫鍵使分子呈緊密橢圓形有助于溶菌酶分泌到胞外[14-15]。九香蟲溶菌酶CcLys2的氨基酸序列在相應(yīng)位點也有8個半胱氨酸殘基，具有C-型溶菌酶的特征。Glu和Asp是溶菌酶活性中心的關(guān)鍵氨基酸，是溶菌酶發(fā)揮水解功能必不可少的功能結(jié)構(gòu)域，通過協(xié)同作用催化β-1，4-糖苷鍵的水解[16-17]，CcLys2也具有相似的活性位點Glu32和Asp50。C-型溶菌酶可分為鈣結(jié)合亞型與非鈣結(jié)合亞型[18]，鈣結(jié)合型溶菌酶分別在第101、106和107保守位點上具有結(jié)合鈣離子的3個Asp殘基。九香蟲溶菌酶CcLys2具有這3個保守的Asp，因而應(yīng)屬于C-型溶菌酶的鈣結(jié)合亞型。人、雞和昆蟲的C-型溶菌酶約有150個氨基酸殘基，而本研究中成熟CcLys2具有210個氨基酸，所增加或缺少的氨基酸殘基都不屬于酶活性中心和結(jié)構(gòu)上的保守位點，推測這不影響其活性及構(gòu)象?？傊?，九香蟲溶菌酶CcLys2具有4個二硫鍵、2個C-型溶菌酶酶活性中心的關(guān)鍵氨基酸及鈣離子結(jié)合位點，這些結(jié)構(gòu)特征表明，CcLys2很有可能具有消化性溶菌酶的生物活性，當(dāng)然其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系有待進一步深入研究。

本研究克隆了一種九香蟲溶菌酶基因CcLys2，并分析了溶菌酶蛋白結(jié)構(gòu)特征，該酶可能屬于具有消化作用的C-型溶菌酶，為今后進一步研究該基因的功能及開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

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