姜炅，戴社教，陳芬榮，董蕾，劉欣

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安710000

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其主要治療手段是手術(shù)切除[1]。盡管早期胃癌切除術(shù)后患者的預(yù)后能得到明顯改善，但由于癌細(xì)胞的耐藥性及侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)等特點(diǎn)，導(dǎo)致胃癌患者的生存率偏低[2,3]。伊沙佐米是一類影響泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的小分子靶向藥物，能直接抑制蛋白酶體，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)已證實(shí)，伊沙佐米治療復(fù)發(fā)性多發(fā)骨髓瘤效果較好[4,5]，美國(guó)、歐洲以及中國(guó)均已批準(zhǔn)其應(yīng)用于臨床[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，伊沙佐米可抑制骨肉瘤、結(jié)腸癌以及黑色素瘤等惡性腫瘤的進(jìn)展[7～9]，但其對(duì)胃癌的影響尚缺乏研究。2019年3～9月，本研究觀察了伊沙佐米對(duì)于胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)于湖南湘雅醫(yī)學(xué)院。主要藥物及試劑：伊沙佐米購(gòu)于日本武田公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；兔抗Wnt、β-catenin及NF-κB抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin兔抗購(gòu)于北京中杉金橋有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的SGC-7901細(xì)胞，隨機(jī)分為12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組和對(duì)照組，分別加入終濃度為12.5、25、50、100 μmol/L的伊沙佐米及相同體積PBS。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞用0.25%胰酶進(jìn)行消化，制成密度為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，以1×104/孔接種于96孔板。將細(xì)胞按照1.2進(jìn)行分組處理，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組分別于作用24、48、72 h，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃條件下孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。

1.4 細(xì)胞凋亡能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，制成密度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，以2×105/孔接種于12孔板。參照1.2進(jìn)行分組處理，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞遷移、侵襲能力觀察 采用Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，制成密度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，取100 μL加入Transwell上室，參照1.2進(jìn)行分組處理。Transwell下室加入500 μL的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出上室，甲醛固定，結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。侵襲實(shí)驗(yàn)需在濾膜表面涂5 μg Matrigel，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.6 細(xì)胞Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。各組分組處理24 h，使用RIPA提取總蛋白，按照蛋白濃度與5×SDS蛋白上樣緩沖液以1∶4混合。煮沸變性后，10% SDS-PAGE分離樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2 h，加入Wnt、β-catenin、NF-κB一抗(稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 500、1∶1 500)，室溫孵育2 h；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶2 000)，室溫孵育2 h。暗室中加入ECL試劑,使用Bio-Rad照相系統(tǒng)進(jìn)行照相，并用其附帶軟件分析條帶灰度值,計(jì)算Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力比較 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞增殖能力均呈升高趨勢(shì)。相同作用時(shí)間下，對(duì)照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細(xì)胞增殖能力依次降低，兩組間比較P均<0.05。見圖1。

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線(CCK-8法)

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細(xì)胞凋亡率分別為1.99%±0.83%、6.72%±1.42%、17.79%±2.19%、28.50%±5.18%、60.94%±7.47%，組間兩兩比較P均<0.05。見圖2。

2.3 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 對(duì)照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(827±11)、(623±13)、(477±21)、(385±38)、(192±9)個(gè)，侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(811±35)、(601±15)、(419±22)、(372±13)、(174±21)個(gè)，組間兩兩比較P均<0.05。

2.4 各組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。見表1、圖3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞術(shù))

表1 各組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達(dá)情況

圖3 各組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

3 討論

伊沙佐米是一類蛋白酶體抑制劑，能直接結(jié)合并抑制蛋白酶體，使異常蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚；或可通過(guò)減少抑癌基因產(chǎn)物降解，而抑制癌細(xì)胞活動(dòng)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[4,5]。Tibullo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，伊沙佐米能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是誘導(dǎo)DR5表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致TRAIL/死亡受體信號(hào)通路靶向CRC敏感。目前關(guān)于伊沙佐米對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為影響的研究較少。本研究結(jié)果顯示，相同作用時(shí)間下，對(duì)照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmmol/L組細(xì)胞增殖能力及遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)均依次降低，細(xì)胞凋亡率依次升高；這表明伊沙佐米可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且這種影響隨著伊沙佐米濃度的升高而更加明顯。

NF-κB通路可參與細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，可控制細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄，并參與細(xì)胞對(duì)有害刺激的反應(yīng)。在癌細(xì)胞中，NF-κB通常呈過(guò)表達(dá)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB異常表達(dá)可降低免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的清除，并促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外，NF-κB還可通過(guò)調(diào)節(jié)抗凋亡基因腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)來(lái)減少細(xì)胞凋亡[12]。研究發(fā)現(xiàn)，其他的蛋白酶體抑制劑如硼替佐米等亦能抑制NF-κB表達(dá)[13]，推測(cè)硼替佐米等抑制蛋白酶體后，NF-κB的上游蛋白IκB降解減少，而IκB可抑制NF-κB活性。此外還有研究認(rèn)為[14]，NF-κB的前體分子必須經(jīng)泛素化和蛋白酶體降解后，才可轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚苑肿?，因此抑制蛋白酶體可減少NF-κB生成。Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白包括Wnt、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和β-catenin。Wnt分泌到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的受體相互作用并將信號(hào)傳遞給細(xì)胞，從而抑制GSK-3β生成。β-catenin可以進(jìn)入細(xì)胞核并形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，同時(shí)激活Wnt信號(hào)通路的靶基因，如cyclinD1和c-myc，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。另一方面，GSK-3β可通過(guò)磷酸化作用促進(jìn)β-catenin降解，并抑制細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低，表明伊沙佐米對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響可能與其抑制Wnt/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。伊沙佐米的這種作用機(jī)制可能是通過(guò)減少GSK-3β降解實(shí)現(xiàn)的，未來(lái)需進(jìn)一步探討其分子機(jī)制。