韓 超，胡貝貞，金 娜，劉 濱，沈 燕，金建昌，陳樹(shù)兵*

（1.浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015；2.紹興海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江 紹興 312000；3.溫州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江 溫州 325027；4.寧波海關(guān)技術(shù)中心，浙江 寧波 315040）

氟蟲(chóng)腈是世界上首個(gè)苯基吡唑類(lèi)殺蟲(chóng)劑，也是一種廣譜殺蟲(chóng)劑，能夠有效殺死跳蚤、虱子等生物[1-2]。世界衛(wèi)生組織表示，人類(lèi)食用含有一定濃度的氟蟲(chóng)腈食品，會(huì)損傷腎臟和肝臟，因而被世界衛(wèi)生組織列為“對(duì)人類(lèi)有中度毒性”的化學(xué)品[3]。另外，氟蟲(chóng)腈化學(xué)性質(zhì)較為活潑，在環(huán)境中經(jīng)水解和光解作用，能夠產(chǎn)生代謝產(chǎn)物氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈硫醚，代謝產(chǎn)物的毒性遠(yuǎn)高于母體氟蟲(chóng)腈。美國(guó)對(duì)雞蛋中的氟蟲(chóng)腈的限量要求為0.02 mg/kg，歐盟規(guī)定氟蟲(chóng)腈不得用于人類(lèi)食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過(guò)程，對(duì)所有食品的限量要求均為0.005 mg/kg。GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，規(guī)定了氟蟲(chóng)腈及代謝產(chǎn)物氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈硫醚之和在禽肉、禽蛋、禽內(nèi)臟的限量要求分別為0.01、0.02、0.02 mg/kg。酰胺氟蟲(chóng)腈盡管未被GB 2763—2019列入監(jiān)控范圍，國(guó)外已有報(bào)道在秋葵及蜂蜜和花粉中將酰胺氟蟲(chóng)腈作為氟蟲(chóng)腈代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[4-5]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定主要有氣相色譜法[6-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）法[13-14]、液相色譜法[15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-21]和免疫分析法[20-23]。由于含有多個(gè)鹵原子，氟蟲(chóng)腈及其代謝物的電負(fù)性極強(qiáng)，適用于負(fù)化學(xué)源（negative chemical ionization，NCI）測(cè)定，同時(shí)樣品溶劑和儀器本底中氧、硫等雜原子響應(yīng)值低，由此提高了信噪比，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道采用GC-NCI-MS/MS對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定[24-25]。GC-MS/MS法多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multireaction monitoring，MRM）模式實(shí)現(xiàn)了在復(fù)雜基質(zhì)背景下對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確測(cè)定。有關(guān)動(dòng)物源食品（禽肉、禽蛋、禽內(nèi)臟）中氟蟲(chóng)腈及其4 種代謝產(chǎn)物（氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚、酰胺氟蟲(chóng)腈）殘留的GC-NCI-MS/MS同時(shí)測(cè)定鮮見(jiàn)報(bào)道。QuEChERS由于其具有簡(jiǎn)便、快速、環(huán)境友好、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，在食品農(nóng)、獸藥殘留分析中得到了廣泛的應(yīng)用[26-27]。本研究采用QuEChERS法結(jié)合GC-NCI-MS/MS同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源食品（雞蛋、雞肉、雞肝）中氟蟲(chóng)腈及其4 種代謝產(chǎn)物（氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚、酰胺氟蟲(chóng)腈）殘留量，該方法靈敏度高、選擇性好，能夠滿(mǎn)足動(dòng)物源食品中氟蟲(chóng)腈及其4 種代謝產(chǎn)物殘留量的確證和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、雞肉、雞肝市購(gòu)。

氟蟲(chóng)腈標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 120068-37-3，純度97.5%）、酰胺氟蟲(chóng)腈（CAS205060-69-7，純度97.5%）、氟甲腈（CAS205060-65-3，純度98.0%）、氟蟲(chóng)腈砜（CAS120068-36-2，純度98.5%）、氟蟲(chóng)腈硫醚（CAS 120067-83-6，純度98.0%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；各個(gè)化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 氟蟲(chóng)腈及4 種代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of fipronil and four metabolites

乙腈、正己烷（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；鹽析包（含4 g硫酸鎂、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸鈉半水合物、1 g氯化鈉）和凈化管（含150 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C18） 月旭科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300-TSQ 8000三重四極桿GC-MS聯(lián)用儀（配有NCI）、ST16 R離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；GM 200組織搗碎機(jī) 德國(guó)萊馳公司；MS 105DU電子天平、PL 203電子天平 美國(guó)梅特勒-托利多公司；T18型均質(zhì)器德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

取有代表性樣品500 g，將其切碎后，用組織搗碎機(jī)將樣品加工成漿狀，混勻，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標(biāo)明標(biāo)記。稱(chēng)10 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（正己烷飽和），15 000 r/min高速均質(zhì)2 min后加入鹽析包，劇烈振搖2 min，10 000 r/min高速離心5 min，取1 mL乙腈層提取物于10 mL離心管中，加入1 mL正己烷（乙腈飽和）渦旋混勻，靜置分層，棄去正己烷層，加入1 mL正己烷重復(fù)一遍。取乙腈層加入到2 mL凈化管中，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min高速離心5 min，取上清液供GC-NCI-MS/MS測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)取每種適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈制得100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。按1.3.1節(jié)方法制備不含待測(cè)組分的空白基質(zhì)溶液，配制質(zhì)量濃度分別為1、2、5、20、50、100 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 GC條件

HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初溫60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至200 ℃，再以15 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度240 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速1.0 mL/min。

1.3.4 MS條件

電離模式：NCI，反應(yīng)氣為甲烷（純度≥99.99%）；電離能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度250 ℃；MRM模式，具體條件見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)物的MRM分析條件Table 1 MRM MS conditions for target compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

由于氟蟲(chóng)腈及其4 種代謝產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)中（圖1）都含有6 個(gè)氟原子、2 個(gè)氯原子，具有較強(qiáng)的電負(fù)性，在離子源內(nèi)容易形成負(fù)離子。NCI屬于軟電離技術(shù)，具有較低噪聲背景的巨大優(yōu)勢(shì)，因此選用對(duì)含電負(fù)性基團(tuán)有特異響應(yīng)的NCI技術(shù)進(jìn)行測(cè)定是最好的選擇[28]。采用NCI源在SCAN模式下，對(duì)5.0 mg/L的氟蟲(chóng)腈及其4 種代謝產(chǎn)物分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，得到每個(gè)目標(biāo)物的母離子。在不同碰撞能量下，對(duì)目標(biāo)物的母離子分別進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到每個(gè)母離子的碎片離子，選擇豐度較高的3～4 個(gè)子離子，配制不同種類(lèi)的空白樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在MRM模式下優(yōu)化各種質(zhì)譜條件，剔除易受雜質(zhì)干擾，選擇豐度最高的2 個(gè)子離子作為定量離子和定性離子，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

雞蛋、雞肉和雞肝等動(dòng)物源樣品含有的一定量脂肪和蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取、高速離心，可以去除蛋白質(zhì)的影響。對(duì)所含的脂肪，需對(duì)QuEChERS提取和凈化進(jìn)行改進(jìn)，采用3 個(gè)步驟去除脂肪：第1步樣品提取的時(shí)候采用正己烷飽和的乙腈，以減少脂肪溶解在乙腈中；第2步采用乙腈飽和的正己烷液液分配2 次去除脂肪，第3步凈化管中含有C18粉，可用于進(jìn)一步去除脂肪。由于本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS/MS的NCI源和MRM模式，具有高選擇性和靈敏度，在此模式下得到的空白雞蛋樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖中目標(biāo)物出峰處無(wú)雜質(zhì)干擾（圖2）。

圖2 空白雞蛋基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（2200 μgg/L）的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of mixed standard solution(20 μg/L) with blank egg matrix

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系與定量限

采用基質(zhì)匹配工作曲線以最大消除基體效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響。采用外標(biāo)法對(duì)1.3.2節(jié)制備的1、2、5、20、50、100 μg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，以各組分的定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在1、2、5、20、50、100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各個(gè)化合物線性關(guān)系良好，線性方程和相關(guān)系數(shù)（r2）見(jiàn)表2。定量限采用在空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度的方法確定，得到氟甲腈、氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈硫醚的定量限（RSN≥10）為0.5 μg/kg，氟蟲(chóng)腈砜、酰胺氟蟲(chóng)腈的定量限（RSN≥10）為1.0 μg/kg。

表2 線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations with correlation coef ficients

2.3.2 回收率與精密度

在不同動(dòng)物源食品的空白樣品中，分別進(jìn)行2.0、10.0、20.0 μg/kg三個(gè)不同質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果見(jiàn)表3，回收率在80.2%～108.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～10.2%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。代表性的空白雞肉樣品加標(biāo)MRM色譜圖見(jiàn)圖3。

表3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果Table 3 Results of spiked recoveries and RSDs

圖3 空白雞肉樣品加標(biāo)（2..0 μg/kg）MRRMM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of spiked blank chicken meat samples(2.0 μg/kg)

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市購(gòu)買(mǎi)不同的動(dòng)物源食品，雞蛋、雞肉、雞肝，每種樣品各15 份，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，有1 個(gè)雞蛋樣品中檢出氟蟲(chóng)腈砜代謝藥物殘留，檢出值為5.2 μg/kg（圖4），沒(méi)有超過(guò)GB 2763—2019限量要求。

圖4 氟蟲(chóng)腈砜陽(yáng)性雞蛋樣品的定量離子MRM色譜圖Fig. 4 MRM chromatogram of a positive egg sample with fipronil sulfone

3 結(jié) 論

采用QuEChERS法提取和凈化，建立動(dòng)物源食品中氟蟲(chóng)腈及其4 種代謝產(chǎn)物（氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚、酰胺氟蟲(chóng)腈）殘留量的GC-NCI-MS/MS測(cè)定方法。本研究在涵蓋GB 2763—2019規(guī)定的禽蛋、禽肉、禽內(nèi)臟中氟蟲(chóng)腈及氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚代謝物基礎(chǔ)上，增加了酰胺氟蟲(chóng)腈的檢測(cè)，通過(guò)選擇NCI源和MRM模式，降低基體干擾，方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，能夠滿(mǎn)足動(dòng)物源食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝產(chǎn)物殘留量的確證和定量分析。