王雨晨, 王延梅

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)高分子科學(xué)與工程系, 安徽 合肥 230026)

毛細(xì)管電泳(CE)是以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力、毛細(xì)管作為分離通道,根據(jù)毛細(xì)管內(nèi)樣品的淌度以及分配行為等進(jìn)行分離的一項(xiàng)液相分離技術(shù)[1]。毛細(xì)管分離技術(shù)使得分析科學(xué)從μL水平上升至nL水平,并且具有分析速度快、分離效率高、樣品消耗量少、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等特點(diǎn),在藥物研究、醫(yī)學(xué)臨床診斷、環(huán)境監(jiān)控分析和食品分析等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。然而在蛋白質(zhì)分離分析領(lǐng)域,常用的熔融硅毛細(xì)管容易吸附蛋白質(zhì),導(dǎo)致電滲流不穩(wěn)定,使得分離結(jié)果重現(xiàn)性變差[2];此外,商用CE中常用的紫外檢測(cè)器(UV)光程短,使得CE-UV的檢測(cè)靈敏度往往不能達(dá)到低豐度蛋白質(zhì)的直接分析要求[3,4]。因此尋找能夠阻止蛋白質(zhì)吸附、同時(shí)能夠提高CE-UV檢測(cè)靈敏度的涂層是毛細(xì)管電泳分離分析蛋白質(zhì)的重要課題之一。

圖 1 幾種常用的引發(fā)劑、終止劑和2-唑啉單體的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of several initiators, termin-ators and 2-oxazoline in common use

本文將結(jié)合近年來(lái)本課題組以及國(guó)內(nèi)外其他研究者的相關(guān)研究工作,對(duì)PMOXA在毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)和評(píng)述。

1 聚(2-甲基-2-唑啉)的抗蛋白質(zhì)吸附作用

在用CE分離分析蛋白質(zhì)之前,采用聚合物修飾毛細(xì)管內(nèi)壁是解決熔融硅毛細(xì)管內(nèi)壁吸附蛋白質(zhì)的常用方法之一。聚合物涂層通?？筛鶕?jù)與毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合方式的不同分為共價(jià)鍵涂層和非共價(jià)鍵涂層。共價(jià)鍵涂層是指聚合物主要通過(guò)共價(jià)鍵鍵合在毛細(xì)管內(nèi)壁形成的涂層。共價(jià)鍵涂層壽命長(zhǎng)，穩(wěn)定性好，分離效率高。但是由于涂層的制備通常需要單體在毛細(xì)管內(nèi)聚合,制備工藝復(fù)雜,聚合反應(yīng)難以控制,容易造成涂層的不均一性,最終使檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性變差[20]。非共價(jià)鍵涂層是指聚合物以非共價(jià)鍵鍵合在毛細(xì)管內(nèi)壁形成的涂層,通常將組成和結(jié)構(gòu)已知的聚合物配成溶液,充入毛細(xì)管,聚合物通過(guò)與毛細(xì)管內(nèi)壁之間的氫鍵、靜電引力、疏水基團(tuán)間的相互作用等在毛細(xì)管內(nèi)壁形成涂層。非共價(jià)鍵涂層毛細(xì)管制備過(guò)程簡(jiǎn)單,涂覆過(guò)程可一步完成,但由于非共價(jià)鍵作用力較弱,在分離過(guò)程中涂層易被緩沖溶液沖出毛細(xì)管,造成涂層不穩(wěn)定。

受貽貝類(lèi)海洋生物足絲分泌的黏液在潮濕的環(huán)境下依然具有超強(qiáng)黏附性的啟發(fā),Lee等[21]在pH 8.5的緩沖液和氧氣存在的條件下,以多巴胺(DA)為單體,在不同基質(zhì)(如貴金屬、金屬氧化物、二氧化硅、有機(jī)高分子等)的材料上制備出具有強(qiáng)黏附性的聚多巴胺(PDA)涂層[22-24],該涂層在一個(gè)很寬的pH值范圍內(nèi)(pH=1.0～12.0)均保持良好的穩(wěn)定性,并且可以進(jìn)一步與帶有功能團(tuán)(如-NH2、-SH等)的聚合物進(jìn)行席夫堿或邁克爾加成反應(yīng)[25-27]。

Xiang等[28]首先在不同材料(如玻璃、金片等)表面修飾PDA涂層,然后將末端帶有氨基的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA-NH2)通過(guò)PDA接枝在材料表面,即通過(guò)兩步法制備聚多巴胺接枝聚(2-甲基-2-唑啉)(PDA-g-PMOXA)涂層(見(jiàn)圖2)。表面等離子共振(SPR)結(jié)果表明,溶菌酶在PDA-g-PMOXA修飾的芯片表面的吸附量是79.39 ng/cm2,而在聚多巴胺接枝聚乙二醇單甲醚(PDA-g-mPEG)修飾的芯片表面的吸附量是101.20 ng/cm2,說(shuō)明PDA-g-PMOXA涂層的抗蛋白質(zhì)吸附性能更好。水接觸角的測(cè)試結(jié)果表明,PDA-g-PMOXA涂層比PDA-g-mPEG涂層更穩(wěn)定。CE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PDA-g-PMOXA涂層毛細(xì)管在10 min內(nèi)能有效地分離出溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A、α-胰凝乳蛋白酶原A、胰蛋白酶抑制劑、肌球素這6種酸、堿、中性蛋白質(zhì)混合物,遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.05%,理論塔板數(shù)(N)大于8.0×104/m,并且能將雞蛋清中的酸性蛋白質(zhì)和堿性蛋白質(zhì)有效分離。

為了進(jìn)一步提高PMOXA涂層毛細(xì)管阻抗蛋白質(zhì)吸附的性能,Zhang等[29]通過(guò)DA輔助共沉積法(一步法)來(lái)提高PMOXA在毛細(xì)管內(nèi)壁的接枝密度。他們將部分水解的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA-EI)與DA混合,通過(guò)DA的氧化聚合以及PMOXA-EI主鏈中的亞氨基和PDA之間的邁克爾加成反應(yīng),分別制備了聚(2-甲基-2-唑啉-乙烯亞胺)的一次(PDA/PMOXA-EI)及二次(PDA/PMOXA-EI+PMOXA-EI)涂層毛細(xì)管(見(jiàn)圖2)。這種涂層毛細(xì)管對(duì)4種堿性蛋白質(zhì)的混合物(溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A)可進(jìn)行有效分離,N值最高可達(dá)5.4×105/m,遷移時(shí)間的RSD值均小于0.17%。在低pH值時(shí)(pH 2.53), PDA/PMOXA-EI+PMOXA-EI聚合物鏈上的仲胺會(huì)發(fā)生質(zhì)子化,使涂層管帶正電荷,可以與同樣質(zhì)子化的三聚氰胺(MEL)間發(fā)生靜電排斥作用,阻止MEL在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附,因此該涂層毛細(xì)管可用于奶粉中MEL的檢測(cè)。研究表明,在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,MEL的檢出限為0.097 μg/mL,奶粉中可以檢測(cè)到MEL的最低量為4 mg/kg, MEL的加標(biāo)回收率為92.13%～102.47%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.07%～4.98%,并且涂層在45 d內(nèi)仍保持良好的穩(wěn)定性。該方法使得實(shí)際奶粉樣品中MEL的檢測(cè)更加經(jīng)濟(jì)有效。

圖 2 以PDA為黏合層制備不同類(lèi)型PMOXA涂層的示意圖Fig. 2 Diagram of preparing different types of PMOXA coatings using PDA as the anchor PDA: polydopamine; PMOXA: poly(2-methyl-2-oxazoline); PDA-g-PMOXA: polydopamine-graft-poly (2-methyl-2-oxazoline); PMOXA-EI: poly (2-methyl-2-oxazoline-co-ethyleneimine); PEI-g-PMOXA: poly(ethyleneimine)-graft-poly (2-methyl-2-oxazoline).

為了進(jìn)一步提高PMOXA在毛細(xì)管內(nèi)壁的覆蓋率,增強(qiáng)涂層的抗蛋白質(zhì)吸附能力,Du等[30]根據(jù)之前多臂星形超支化聚乙烯亞胺接枝聚(2-甲基-2-唑啉)(PEI-g-PMOXA)的研究結(jié)果[31],以超支化分子聚乙烯亞胺(PEI)作為支架,合成了一系列結(jié)構(gòu)明確、具有不同PMOXA接枝率和鏈長(zhǎng)(分子量)的多臂星形超支化PEI-g-PMOXA,并采用DA輔助共沉積法(一步法)[32],快速將PEI-g-PMOXA固定在毛細(xì)管內(nèi)壁(見(jiàn)圖2)。該涂層毛細(xì)管分離4種堿性蛋白質(zhì)混合物(溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A)時(shí),所得峰的N值可達(dá)105量級(jí);同一根PEI-g-PMOXA涂層毛細(xì)管連續(xù)分離30次后,4種蛋白質(zhì)遷移時(shí)間的RSD均小于0.7%。基于PEI-g-PMOXA涂層管良好的穩(wěn)定性和優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附性能,將其用于前沿分析毛細(xì)管電泳法(FACE)測(cè)定小分子陽(yáng)離子藥物對(duì)乙酰氨基酚(APAP)與牛血清白蛋白(BSA)之間相互作用的參數(shù)。結(jié)果表明,連續(xù)3次分析的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)的RSD值分別為5.1%和1.4%,連續(xù)3 d的Ka和n的RSD值分別為9.0%和2.4%,所得結(jié)果與熒光光譜法以及其他文獻(xiàn)[33]中報(bào)道的結(jié)果相近,說(shuō)明該方法具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

除了以PDA為黏合層的方法外,Bai等[34]通過(guò)加熱的方法,在硅、玻璃等表面制得了PMOXA涂層。他們首先以甲基丙烯酸(MAA)為終止劑,終止MOXA的陽(yáng)離子開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng),得到聚(2-甲基-2-唑啉)大分子單體(PMOXA-MA)。然后通過(guò)自由基共聚,合成了梳狀的聚(2-甲基-2-唑啉)-r-甲基丙烯酸縮水甘油酯(PMOXA-r-GMA)無(wú)規(guī)共聚物。Mao等[35]利用該梳狀共聚物中GMA組分中的環(huán)氧基團(tuán)在加熱條件下可以與毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)這一特性,通過(guò)熱致固化的方法制備出PMOXA-r-GMA涂層毛細(xì)管。該涂層毛細(xì)管成功地分離了4種堿性蛋白質(zhì)的混合物(溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A),N值可達(dá)8.3×105/m,遷移時(shí)間的RSD值可低至0.1%。該涂層毛細(xì)管還可以定量檢測(cè)嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白(Lf)的含量,向嬰幼兒奶粉樣品中外加0.40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)Lf后,檢測(cè)到Lf的含量是(0.39±0.02) mg/mL,回收率可達(dá)97.8%±5.1%。這種涂層毛細(xì)管在分析嬰幼兒奶粉樣品時(shí)前處理簡(jiǎn)單,分離時(shí)間較短(6 min),涂層毛細(xì)管連續(xù)使用50次后,Lf遷移時(shí)間和峰面積的RSD值分別為1.1%和2.9%,為嬰幼兒奶粉中Lf的檢測(cè)提供了簡(jiǎn)單可行的方法。

2 PMOXA對(duì)BSA和溶菌酶(Lyso)的在線(xiàn)富集及檢測(cè)信號(hào)放大作用

在CE-UV用于蛋白質(zhì)的分析過(guò)程中,樣品進(jìn)樣體積小，檢測(cè)光程短,導(dǎo)致樣品的檢測(cè)靈敏度不高,不能達(dá)到痕量蛋白質(zhì)的直接檢測(cè)要求。解決上述問(wèn)題的常見(jiàn)方法有:對(duì)樣品進(jìn)行前處理以提高樣品的純度、重新設(shè)計(jì)檢測(cè)器、在線(xiàn)(on-line)富集目標(biāo)分析物等[36,37]。其中在線(xiàn)富集技術(shù)不需要對(duì)儀器本身進(jìn)行任何改造,主要通過(guò)改變目標(biāo)分析物在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速率,使待測(cè)樣品發(fā)生堆積,從而提高待測(cè)樣品通過(guò)檢測(cè)器的濃度,達(dá)到提高檢測(cè)靈敏度的目的。常用的在線(xiàn)富集技術(shù)有堆積法、動(dòng)態(tài)pH界面法、吹掃法、瞬間等速電泳法、毛細(xì)管涂層法等[38-41]。毛細(xì)管涂層法是指:將對(duì)蛋白質(zhì)具有可逆吸附功能的聚合物涂覆在毛細(xì)管內(nèi)壁,形成聚合物涂層毛細(xì)管,該涂層毛細(xì)管在某一條件下能吸附目標(biāo)蛋白質(zhì),在另一條件下能將所吸附的目標(biāo)蛋白質(zhì)全部釋放,具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì),提高蛋白質(zhì)分析靈敏度的功能。

這種具有可逆吸附功能的聚合物通常具有刺激響應(yīng)性,它可以對(duì)外界的某種刺激(如溫度、pH值、光、溶劑、離子強(qiáng)度(I)等)做出相應(yīng)的反應(yīng)(如顏色、潤(rùn)濕性、蛋白質(zhì)吸附等變化)[42-44]。聚丙烯酸(PAA)是一類(lèi)常見(jiàn)的具有pH響應(yīng)性的聚合物,隨著環(huán)境pH值和離子強(qiáng)度的改變,PAA鏈在溶液中會(huì)溶脹和塌縮[45-47],從而達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)的可控吸附與釋放。研究發(fā)現(xiàn),如果只是單純的PAA組成的聚合物刷,只能釋放出部分吸附的蛋白質(zhì);當(dāng)PAA和具有抗蛋白質(zhì)吸附的聚合物(如PEG)組成二元混合刷時(shí)[48-51],在一定條件下能吸附蛋白質(zhì),當(dāng)改變條件時(shí)又能將所吸附的蛋白質(zhì)幾乎全部釋放。Pan等[27]通過(guò)PDA將PMOXA和PAA依次接枝在不同的基底(如玻璃、硅、金等)上,制備了PMOXA/PAA二元混合刷。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)PAA的理論鏈長(zhǎng)較PMOXA長(zhǎng),在pH=5.0(I=10-5mol/L)時(shí),由于PAA鏈處于伸展?fàn)顟B(tài),涂層可以吸附大量的BSA;而在pH=9.0(I=10-1mol/L)時(shí),由于PAA鏈中羧基的解離,使涂層帶負(fù)電,并且由于鹽效應(yīng),PAA鏈發(fā)生塌縮,因此可將之前吸附的帶負(fù)電荷的BSA釋放出來(lái),同時(shí)處于涂層表面的PMOXA會(huì)進(jìn)一步阻止蛋白質(zhì)的吸附。Gong等[52]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)PAA的接枝密度約為PMOXA的一半,在pH=7.0(I=10-5mol/L)時(shí),PAA鏈處于伸展?fàn)顟B(tài),可以通過(guò)靜電作用吸附帶正電荷的Lyso;當(dāng)pH=3.0(I=10-1mol/L)時(shí),由于羧酸根的質(zhì)子化以及鹽效應(yīng),PAA鏈塌縮,減弱了PAA與Lyso之間的靜電吸引作用,使之前吸附的Lyso得以釋放,同時(shí)暴露在外的PMOXA鏈阻止了Lyso的進(jìn)一步吸附,此時(shí)Lyso的脫附率可達(dá)91.3%(見(jiàn)圖3)。

圖 3 BSA或Lyso在PMOXA/PAA混合刷上的吸附和解吸附Fig. 3 Adsorption and desorption of BSA or Lyso on the PMOXA/PAA mixed brushes BSA: bovine serum albumin; Lyso: lysozyme; PAA: polyacrylic acid; I: ion strength.

將上述具有pH和I響應(yīng)性的PMOXA/PAA混合刷修飾到毛細(xì)管內(nèi)壁,可以通過(guò)改變緩沖溶液的pH和I,調(diào)控涂層對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附和釋放,釋放的蛋白質(zhì)在電滲流和電泳的雙重作用下快速遷移,到達(dá)UV檢測(cè)器的蛋白質(zhì)瞬時(shí)濃度大大增加,使目標(biāo)蛋白質(zhì)得到富集,CE-UV對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的檢測(cè)信號(hào)得到放大,從而達(dá)到提高低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度的目的(見(jiàn)圖4)。Liu等[53]通過(guò)PDA將PMOXA和PAA接枝在毛細(xì)管內(nèi)壁,制備出PDA/PMOXA/PAA涂層毛細(xì)管,并將其用于BSA的在線(xiàn)富集。結(jié)果表明,在pH=5.0(I=10-5mol/L)時(shí),涂層毛細(xì)管可吸附大量的BSA;在pH=9.0(I=10-1mol/L)時(shí),吸附的BSA發(fā)生脫附。PDA/PMOXA/PAA涂層毛細(xì)管基于峰高和峰面積的靈敏度提高因子(SEF)分別為5 498和3 649,即BSA的稀溶液在聚合物涂層毛細(xì)管中得到了富集。Hou等[54]的研究結(jié)果表明,當(dāng)PAA鏈長(zhǎng)(12.5 nm)是PMOXA鏈長(zhǎng)(8 nm)的1.56倍時(shí),PDA/PMOXA/PAA涂層毛細(xì)管可以達(dá)到最佳的在線(xiàn)富集效果。在pH=7.0(I=10-5mol/L)時(shí),Lyso可吸附在涂層毛細(xì)管內(nèi)壁上;在pH=3.0(I=10-1mol/L)時(shí),涂層與Lyso之間的靜電作用大大減弱,大部分吸附的Lyso得以釋放。該方法對(duì)Lyso的最低檢出限達(dá)到4.5×10-9mg/mL,檢測(cè)信號(hào)放大了1.0×105倍,極大提高了CE對(duì)Lyso的檢測(cè)靈敏度。

圖 4 PDA/PMOXA/PAA涂層毛細(xì)管對(duì)BSA或Lyso的在線(xiàn)富集機(jī)理Fig. 4 On-line preconcentration mechanism of BSA or Lyso in PDA/PMOXA/PAA coated capillaryEOF: electroosmotic flow.

3 結(jié)論與展望