張 淼, 王雨晨, MUHAMMAD Atif, 陳麗娟, 王延梅*

(1. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)高分子科學(xué)與工程系, 安徽 合肥 230026;2. 皖西學(xué)院材料與化工學(xué)院, 安徽 六安 237012)

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶,是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的堿性蛋白質(zhì)。溶菌酶不僅可以水解細菌細胞壁中的肽聚糖,導(dǎo)致細胞壁破裂,菌體溶解,而且能夠與病毒蛋白直接結(jié)合使病毒失活,具有抗菌、抗病毒、消炎等功效而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[1,2]。此外,溶菌酶常被用作模型蛋白,用于研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象、酶動力學(xué)及其與分子免疫間的關(guān)系等[3]。目前,常用的溶菌酶檢測方法有分光光度法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]和毛細管電泳法(CE)[7]等。CE由于分析速度快、分離效率高、試劑消耗量少等優(yōu)點,廣泛用于蛋白質(zhì)的分離分析中[8-10]。紫外檢測器(UV)是CE常用的檢測方式,但是由于毛細管進樣體積小和檢測光程短等,使CE-UV的檢測靈敏度受到限制[11]。提高檢測靈敏度的常用方法有:采用高靈敏度的檢測器[12]、使用離線富集技術(shù)和在線富集技術(shù)[13,14]等。激光誘導(dǎo)熒光檢測器具有較高的檢測靈敏度,但是對待測物繁瑣的衍生過程和高昂的成本限制了其廣泛應(yīng)用。離線富集技術(shù)需要對目標分析物進行過濾、萃取、吸附等前處理以提高檢測靈敏度,該方法試劑消耗量大、操作過程繁瑣。在線富集技術(shù)則是通過調(diào)節(jié)目標分析物所處狀態(tài)以及儀器參數(shù)使分析物得到高倍富集,從而達到提高檢測靈敏度的目的,具有操作簡便、價格低廉等優(yōu)點。目前常用的毛細管電泳在線富集技術(shù)主要包括樣品堆積、動態(tài)pH界面、吹掃、瞬間等速電泳等[14],此外,利用具有刺激響應(yīng)性的混合刷涂層毛細管實現(xiàn)蛋白質(zhì)的在線富集是提高檢測靈敏度的一種新思路[15,16]。

混合刷是由兩種及兩種以上的聚合物鏈接枝在基底上形成的刷狀表面[17]。由刺激響應(yīng)性聚合物和具有抗蛋白質(zhì)吸附性能的聚合物組成的混合刷在調(diào)控蛋白質(zhì)吸附方面有廣泛的研究[18,19]。聚丙烯酸(PAA)是一種常見的刺激響應(yīng)性聚合物,將PAA和具有抗蛋白質(zhì)吸附性能的聚合物接枝到基底表面形成混合刷,隨著外界環(huán)境(pH和離子強度(I))的改變,PAA鏈構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致混合刷中兩種聚合物交替暴露在外面,涂層呈現(xiàn)出不同的性質(zhì),從而調(diào)節(jié)涂層與蛋白質(zhì)之間的相互作用。Delcroix等[20-22]制備了由PAA與具有抗蛋白質(zhì)吸附性能的聚乙二醇(PEO)組成的混合刷,在pH 7 (I=10-5mol/L)條件下,PAA鏈帶負電荷且呈伸展狀態(tài),可吸附大量的溶菌酶;在pH 3 (I=10-1mol/L)時,PAA鏈不帶電荷且處于塌縮狀態(tài),之前吸附的溶菌酶得以釋放,同時暴露在外表面的PEO可以阻抗蛋白質(zhì)進一步吸附。與單組分PAA刷相比,PEO的加入使混合刷對溶菌酶的脫附率大大提高。Gong等[23]通過聚多巴胺(PDA)依次將聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA)及PAA接枝在玻璃/硅表面形成PMOXA/PAA混合刷,當PAA接枝密度為PMOXA的一半時,混合刷可以達到與單組分PAA刷相同數(shù)量級的溶菌酶吸附量(898.4 ng/cm2),而脫附率接近單組分PMOXA刷的脫附率(91.3%),實現(xiàn)了對溶菌酶的可逆吸附。Hou等[15]利用上述方法制備了PMOXA/PAA混合刷涂層毛細管,用于毛細管電泳在線富集溶菌酶。結(jié)果表明,當PAA鏈長為PMOXA鏈長的1.56倍時,其檢測信號強度是普通電泳法檢測信號的26倍。然而,該涂層毛細管的制備過程繁瑣,所用時間較長。

研究表明,甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)的環(huán)氧基團與基底表面的官能團(-OH、-NH2)在加熱時可發(fā)生反應(yīng),形成穩(wěn)定的共價鍵涂層[24-26],同時,GMA之間的自交聯(lián)反應(yīng)可使涂層的穩(wěn)定性進一步增強。我們之前的研究表明[27,28], GMA可以分別通過自由基共聚和可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合與PMOXA和PAA形成共聚物,即聚(2-甲基-2-唑啉)-r-甲基丙烯酸縮水甘油酯(PMOXA-r-GMA)和聚丙烯酸-b-聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PAA-b-PGMA)。將PMOXA-r-GMA和PAA-b-PGMA的混合溶液旋涂在硅片上,經(jīng)過加熱即可制備出基于PMOXA和PAA的刺激響應(yīng)性混合刷,實現(xiàn)對溶菌酶的可控吸附和釋放?；谝陨涎芯?本文通過一步加熱法制備了PMOXA-r-GMA/PAA-b-PGMA涂層毛細管,并將其用于毛細管電泳在線富集溶菌酶,為毛細管電泳檢測痕量蛋白質(zhì)提供了一種簡單的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

VG ESCALAB MK Ⅱ型X射線光電子能譜儀(英國VG Scientific Instruments公司); Olympus BX81光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);熔融石英毛細管(內(nèi)徑50 μm,外徑365 μm,總長40 cm,有效長度30 cm,河北永年銳灃色譜器件有限公司); P/ACE MDQ毛細管電泳儀(美國Beckman公司)。

GMA(純度97%)購自上海阿拉丁公司,使用前用堿性氧化鋁除去其中的阻聚劑;MOXA(純度98%)購自Sigma公司,使用前用氫化鈣干燥,然后常壓蒸餾;N,N-二甲基甲酰胺(DMF,分析純)、丙烯酸(AA,化學(xué)純)、甲基丙烯酸(MAA,化學(xué)純)、乙腈(分析純)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司,使用前減壓蒸餾;溶菌酶(Mr約14.3 kDa,等電點約為11.1)購自Biosharp公司;三氟甲磺酸甲酯(MeOTf,純度≥98%)、異硫氰酸熒光素(FITC)購自Sigma公司;偶氮二異丁腈(AIBN)購自天津市光復(fù)精細化工研究所,使用前重結(jié)晶;三乙胺(TEA)、鹽酸、氯化鈉、磷酸、二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、苯甲醇均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;實驗用水為去離子水,購自合肥藍藍水業(yè)。

1.2 溶液的配制

將二水合磷酸二氫鈉溶于水,用氫氧化鈉、磷酸和氯化鈉調(diào)節(jié)pH和I分別配制成pH 7磷酸鹽緩沖液(I=10-5mol/L)和pH 3磷酸鹽緩沖液(I=10-1mol/L)。

1.3 聚合物的制備[27,28]

以MeOTf為引發(fā)劑、MOXA為單體、MAA和TEA為終止劑,通過陽離子開環(huán)聚合(CROP)得到雙鍵封端的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA-MA)。然后通過GMA與PMOXA-MA的自由基無規(guī)共聚,得到梳狀的PMOXA-r-GMA(簡稱PMG)。通過氫的核磁共振譜(1H-NMR)得到PMOXA的聚合度為24 (數(shù)均相對分子質(zhì)量為2 140(含端基)),理論鏈長為9.09 nm, PMG中PMOXA-MA與GMA的摩爾比為1.00∶1.78。

以AIBN為引發(fā)劑、十二烷基三硫代碳酸酯為鏈轉(zhuǎn)移劑、AA為單體、DMF為溶劑,通過RAFT聚合合成出聚合度(由1H-NMR得到)分別為21、48和81的PAA(對應(yīng)的數(shù)均相對分子質(zhì)量分別為1 512、3 456和5 832),相應(yīng)的理論鏈長分別為5.28、12.07和20.37 nm。然后以不同鏈長的PAA為鏈轉(zhuǎn)移劑,分別與GMA通過RAFT聚合合成PAA-b-PGMA(簡稱PAG)。根據(jù)PAG中PAA的聚合度,將PAG分別命名為PAG21、PAG48和PAG81,通過1H-NMR得到相應(yīng)的PAG的數(shù)均相對分子質(zhì)量分別為1 963、3 918和6 290。

1.4 涂層毛細管的制備及其表面組成

圖 1 PMG/PAG涂層毛細管的制備過程Fig. 1 Preparation of PMG/PAG coated capillary

采用一步加熱法利用毛細管內(nèi)壁硅羥基與GMA中環(huán)氧基團之間的化學(xué)反應(yīng),將PMG和PAG共價鍵合在毛細管內(nèi)壁,制備PMG/PAG涂層毛細管,具體制備過程如圖1所示。首先對毛細管進行前處理,即用1 mol/L的鹽酸溶液沖洗毛細管15 min,去離子水沖洗5 min,再用1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗毛細管15 min,去離子水沖洗5 min,空氣吹干。將PMG和PAG以1∶1(質(zhì)量比)溶解在水中制備質(zhì)量濃度為20 g/L的涂層液,之后將涂層液注入經(jīng)過前處理的毛細管中,用硅橡膠密封毛細管兩端,于110 ℃條件下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后用去離子水沖洗毛細管,空氣吹干,得到PMG/PAG涂層管。根據(jù)涂層液中PAA的聚合度,將PMG/PAG涂層毛細管分別命名為PMG/PAG21涂層毛細管、PMG/PAG48涂層毛細管和PMG/PAG81涂層毛細管。為了與PMG/PAG涂層毛細管比較,用同樣的方法分別制備了PMG涂層毛細管和PAG涂層毛細管,即將質(zhì)量濃度為20 g/L的PMG或PAG涂層液分別注入經(jīng)過前處理的毛細管中,毛細管兩端密封后于110 ℃下反應(yīng)24 h,最后用去離子水沖洗以除去殘余溶液,空氣吹干,得到PMG涂層毛細管或PAG涂層毛細管。根據(jù)涂層液中PAA的聚合度,將PAG涂層毛細管分別命名為PAG21涂層毛細管、PAG48涂層毛細管和PAG81涂層毛細管。

為了便于用X射線光電子能譜(XPS)分析毛細管涂層的表面組成,用上述同樣的過程對毛細管原材料進行了修飾。

1.5 毛細管電滲流(EOF)和ζ電勢的測定

根據(jù)Williams和Vigh[29]提出的方法,在溫度為25 ℃、波長為214 nm的條件下,以苯甲醇為標記物(0.2 g/L),分別測量裸管及聚合物涂層毛細管在pH 7和pH 3條件下的EOF值(μeof)(公式(1)～(3)[29])。

(1)

Leo=[(tN3-tN2)-(tN2-tN1)]νm

(2)

(3)

其中,Lt、Ld分別為毛細管的總長度和有效長度,tN1、tN2、tN3分別為苯甲醇先后3個峰的遷移時間,Vprog為實驗電壓,tinj和td分別為進樣時間和滯后時間(儀器一般設(shè)定為1 s),tmigr為電泳時間(1 min),tramp-up為儀器設(shè)定值(0.17 min),tramp-down數(shù)值非常小,忽略不計。

毛細管內(nèi)表面的ζ電勢通過公式(4)[30]得到。

(4)

其中,ε0是真空介電常數(shù)(8.85×10-12F/m),η是水的黏度(0.89 mPa·s),εr是水的介電常數(shù)(78.36 F/m)。

1.6 異硫氰酸熒光素標記溶菌酶(FITC-溶菌酶)吸附/脫附實驗

為了更直觀地研究溶菌酶在毛細管中的吸附/脫附行為,我們在25 ℃下做了FITC-溶菌酶在毛細管中的吸附/脫附實驗,具體過程如下:首先用pH 7磷酸鹽緩沖液潤洗裸管和涂層毛細管30 min,之后向毛細管中注入FITC-溶菌酶(1 g/L,磷酸鹽緩沖液,pH 7) 50 min,然后用pH 7磷酸鹽緩沖液沖洗毛細管10 min以除去未吸附的蛋白質(zhì),空氣吹干后截取一段毛細管。剩余的毛細管用pH 3磷酸鹽緩沖液沖洗30 min,空氣吹干后再截取一段毛細管。最后使用單面刀片將截取的兩段毛細管的外涂層(約5 mm長)刮除干凈,置于Olympus BX81光學(xué)顯微鏡下拍攝。用Image J軟件測量拍攝照片的熒光強度。

1.7 毛細管電泳在線富集溶菌酶

毛細管電泳實驗均在溫度為25 ℃、檢測波長為214 nm的條件下進行。將溶菌酶溶于pH 7磷酸鹽緩沖液中配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的溶菌酶儲備液,用pH 7磷酸鹽緩沖液稀釋儲備液得到相應(yīng)濃度的溶菌酶溶液。毛細管電泳在線富集溶菌酶過程如下:首先用pH 7磷酸鹽緩沖液沖洗裸管或涂層毛細管5 min,在20 kV電壓下預(yù)電泳2 min,隨后于3.45 kPa壓力下注入溶菌酶溶液5 s,之后用pH 7磷酸鹽緩沖液沖洗1 min,然后向毛細管中于3.45 kPa壓力下注入pH 3磷酸鹽緩沖液5 s,最后施加20 kV電壓進行分離。同時,用普通電泳法檢測溶菌酶作為對照:用pH 3磷酸鹽緩沖液潤洗裸管5 min,在20 kV電壓下預(yù)電泳2 min,之后于3.45 kPa壓力下注入溶菌酶溶液5 s,最后施加20 kV電壓進行分離。使用32 Karat軟件(美國Beckman公司)采集在線富集法和普通電泳法的譜圖數(shù)據(jù),并分別對兩種方法得到的溶菌酶信號峰進行積分計算,從而得到各自的峰面積,然后根據(jù)公式(5)[31]得到在線富集法的溶菌酶信號檢測靈敏度增強因子(SEF)。

(5)

其中,A1為用涂層毛細管或裸管通過在線富集法得到的峰面積,A0為用裸管通過普通電泳法得到的峰面積,n為稀釋因子(實驗中使用的是同一濃度的溶菌酶溶液,因此n為1)。

表 1 未修飾的毛細管原材料和涂層毛細管原材料的表面元素組成

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細管涂層的表征

圖 2 未修飾的毛細管原材料和涂層毛細管原材料的XPS譜圖Fig. 2 XPS spectra of wide scan for bare and coated capillary raw materials

為便于分析涂層的表面組成,我們通過一步加熱法制備了PMG、PAG和PMG/PAG涂層毛細管原材料,圖2是未修飾的毛細管原材料和各涂層毛細管原材料的XPS譜圖,相應(yīng)的表面元素組成見表1。結(jié)合能為532、400、285和103 eV的信號峰分別對應(yīng)O 1s、N 1s、C 1s和Si 2p,未修飾的毛細管原材料Si元素含量為31.92%,經(jīng)過PMG修飾后Si元素含量顯著降低(3.88%),同時C和N元素含量顯著增加,N與C元素的摩爾比(N/C)由0.02增加至0.17,表明PMG成功地接枝在毛細管原材料表面。與未修飾的毛細管原材料相比,PAG涂層毛細管原材料表面Si信號減弱,而C信號增強,表明PAG成功地接枝在毛細管原材料表面,其中少量的N信號可能是實驗過程中污染所致。毛細管原材料經(jīng)PMG/PAG修飾后,Si和O元素含量減少,N和C元素含量增加,同時N/C(0.10～0.12)在PMG涂層毛細管原材料(0.17)與PAG涂層毛細管原材料(0.02～0.03)之間,表明PMG和PAG同時接枝在毛細管原材料表面。與PMG涂層毛細管原材料和PAG涂層毛細管原材料相比,PMG/PAG涂層毛細管原材料的Si信號減弱,表明PMG/PAG接枝效果更好,結(jié)果與文獻[28]一致。隨著PAA的理論鏈長由5.28 nm增加至20.37 nm, PMG/PAG涂層中N/C由0.12下降至0.10,這是PMG/PAG涂層中羧基含量增加所致。

為進一步對毛細管涂層進行表征,我們測定了裸管和各涂層毛細管分別在pH 3和pH 7條件下的EOF。裸管在pH 3和pH 7條件下的EOF值分別為3.3×10-9m2/(V·s)和4.6×10-8m2/(V·s),即EOF值隨著pH值的增加而增加,說明隨著pH值的增加,熔融硅毛細管內(nèi)壁的硅羥基解離度增加,使EOF表現(xiàn)出強烈的pH值依賴性。與裸管相比,PMG涂層毛細管在pH 3和pH 7條件下EOF值分別下降至3.4×10-10m2/(V·s)和2.5×10-8m2/(V·s),表明電滲流得到了抑制,證明中性聚合物PMG成功地接枝在毛細管內(nèi)表面。和裸管相比,PAG涂層毛細管在pH 3時EOF值降低,而且隨PAA鏈長的增加而下降(PAG21、PAG48和PAG81涂層毛細管的EOF值分別為1.2×10-9m2/(V·s)、1.0×10-9m2/(V·s)和6.5×10-10m2/(V·s));在pH 7時EOF值增加,而且隨PAA鏈長的增加而增加(PAG21、PAG48和PAG81涂層毛細管的EOF值分別為5.2×10-8m2/(V·s)、5.8×10-8m2/(V·s)和6.0×10-8m2/(V·s));上述結(jié)果說明隨著pH值的增加,PAG涂層毛細管中PAA羧基的解離度增加,EOF值增大,而且隨著PAA鏈長的增加,EOF值的變化更大,進一步表明PAG成功地接枝在毛細管內(nèi)表面。PMG/PAG涂層毛細管在pH 3條件下EOF值明顯小于裸管的EOF值(PMG/PAG21、PMG/PAG48、PMG/PAG81涂層毛細管分別為4.8×10-10m2/(V·s)、4.1×10-10m2/(V·s)和3.1×10-10m2/(V·s)),在pH 7條件下EOF值處于PMG涂層毛細管和PAG涂層毛細管之間(PMG/PAG21、PMG/PAG48、PMG/PAG81涂層毛細管分別為3.5×10-8m2/(V·s)、3.9×10-8m2/(V·s)和4.4×10-8m2/(V·s)),表明毛細管內(nèi)表面同時存在PMG和PAG。

以上結(jié)果表明通過一步加熱法在毛細管原材料和毛細管內(nèi)表面可成功制備PMG、PAG和PMG/PAG涂層。與我們之前通過PDA制備PMOXA/PAA混合刷涂層毛細管的三步法[15]相比,該方法只需一步,同時制備時間由之前的35 h縮短為24 h,制備方法省時且簡單易行。

2.2 毛細管的ζ電勢

圖 3 裸管和涂層毛細管在pH 7和pH 3條件下的ζ電勢Fig. 3 Zeta potential values of bare and coated capillaries at pH 7 and pH 3

裸管和聚合物涂層毛細管在pH 7 (I=10-5mol/L)和pH 3 (I=10-1mol/L)條件下的ζ電勢見圖3。由圖3可知,裸管在pH 7和pH 3條件下ζ電勢均為負值且前者ζ電勢的絕對值更大,表明在兩種條件下裸管內(nèi)表面均帶負電荷,而且裸管內(nèi)壁上硅羥基的解離程度隨著pH值的增加而增大,所帶電荷量隨之增加。PMG涂層毛細管在pH 3條件下幾乎不帶電荷,然而在pH 7條件下表面帶負電荷,這可能是溶液中氫氧根離子吸附在PMOXA聚合物鏈上所致[32]。PAG涂層毛細管在pH 7條件下ζ電勢的絕對值明顯高于pH 3下ζ電勢的絕對值,這是由于隨著pH值的增加,PAA中羧基的解離程度增大,導(dǎo)致所帶負電荷量增加;同時,在pH 7下,隨著PAA鏈長增加,PAG涂層毛細管內(nèi)表面羧基含量增加,所帶負電荷增多,ζ電勢的絕對值增大。PMG/PAG涂層毛細管與PAG涂層毛細管具有相同的規(guī)律,即ζ電勢的絕對值隨著pH值的增加以及PAA鏈長的增加而增大;此外,在pH 7條件下,PMG/PAG涂層毛細管所帶負電荷比相同PAA鏈長的PAG涂層毛細管少,這是由于PMG的部分屏蔽所致。由此可見,PMG/PAG涂層毛細管內(nèi)壁所帶電荷量可通過環(huán)境的pH和I進行調(diào)節(jié),這為調(diào)控毛細管與蛋白質(zhì)之間吸附作用的強弱提供了可能。

圖 4 (a)裸管和涂層毛細管在pH 7和pH 3條件下吸附FITC-溶菌酶的熒光照片與(b)相應(yīng)熒光照片的相對熒光強度 Fig. 4 (a) Fluorescence images of fluorescein isothio-cyanate-labeled lysozyme (FITC-lysozyme) adsorbed on bare and coated capillaries at pH 7 and pH 3 and (b) relative fluorescence intensities of above images Relative fluorescence intensity: intensity of FITC-lysozyme adsorbed on PAG81 coated capillary at pH 7 normalized to 100%.

2.3 毛細管對溶菌酶的可控吸附

PAG和PMG/PAG涂層毛細管的ζ電勢隨著環(huán)境pH和I的改變而發(fā)生變化,意味著涂層與帶電大分子如蛋白質(zhì)之間的相互作用也會隨pH和I的改變而發(fā)生變化。圖4是裸管和各涂層毛細管分別在pH 7 (I=10-5mol/L)和pH 3 (I=10-1mol/L)條件下吸附FITC-溶菌酶的熒光照片和相對熒光強度(將PAG81涂層毛細管在pH 7條件下吸附FITC-溶菌酶的相對熒光強度定為100%),相對熒光強度越大表明毛細管對FITC-溶菌酶的吸附量越多。裸管在pH 7條件下呈現(xiàn)較強的熒光,然而當條件變?yōu)閜H 3時熒光強度下降,表明在pH 7時裸管內(nèi)壁帶有負電荷,可通過靜電吸引作用吸附帶正電荷的溶菌酶;當條件變?yōu)閜H 3時,裸管內(nèi)壁所帶負電荷減少,與溶菌酶的靜電吸引作用下降,先前吸附的溶菌酶得以釋放。值得注意的是,在所有毛細管中只有PMG涂層毛細管在兩種條件下熒光強度都非常小,表明PMOXA可以阻抗蛋白質(zhì)的吸附[33,34]。PAG涂層毛細管在pH 7條件下呈現(xiàn)很強的熒光,而且隨著PAA理論鏈長由5.28 nm(PAG21涂層毛細管)增加至20.37 nm(PAG81涂層毛細管),相對熒光強度由64.62%提高至100%;在pH 3條件下,PAG涂層毛細管的熒光較弱,PAG21、PAG48和PAG81涂層毛細管的相對熒光強度分別為29.11%、29.83%和19.30%,表明在pH 7下,PAG涂層毛細管可以吸附大量的溶菌酶,當條件變?yōu)閜H 3時,PAG涂層毛細管釋放出部分溶菌酶,即通過改變pH和I可以實現(xiàn)PAG涂層毛細管對溶菌酶的吸附/釋放。在pH 7條件下,PAA鏈中羧基發(fā)生解離而帶負電荷,PAA鏈由于鏈內(nèi)和鏈間的靜電排斥而呈現(xiàn)伸展的狀態(tài),可通過靜電吸引作用吸附大量的溶菌酶,而且靜電吸引作用隨著PAA鏈中羧基含量的增加而增強,因此PAG81涂層毛細管吸附的溶菌酶最多;在pH 3時,PAA鏈幾乎不帶電荷,鏈間靜電斥力大大減弱,在鹽效應(yīng)的共同作用下PAA鏈呈塌縮的狀態(tài)[35,36],導(dǎo)致PAA鏈與溶菌酶之間的靜電吸引作用降低,從而將之前吸附的溶菌酶釋放出來。

對于PMG/PAG涂層毛細管,在pH 7時呈現(xiàn)較強的熒光,而且隨著PAA理論鏈長由5.28 nm(PMG/PAG21涂層毛細管)增加至20.37 nm(PMG/PAG81涂層毛細管),相對熒光強度由52.67%提高至92.31%,表明PMG/PAG涂層毛細管可吸附大量的溶菌酶,而且吸附量隨著PAA鏈長的增加而提高。在此條件下,PAA鏈帶負電荷且呈伸展的狀態(tài)。當PAA的鏈長(5.28 nm)小于PMOXA的鏈長(9.09 nm)時,PMOXA鏈暴露在最外層,阻礙了帶負電荷的PAA鏈與帶正電荷的溶菌酶之間的相互作用,同時PAA鏈羧基含量較少,因此在PMG/PAG涂層毛細管中PMG/PAG21涂層毛細管對溶菌酶的吸附量最小;當PAA的鏈長(12.07 nm和20.37 nm)大于PMOXA的鏈長(9.09 nm)時,PAA鏈暴露于最外層,容易與溶液中的溶菌酶接觸,溶菌酶可通過靜電吸引作用吸附在PAA鏈上,而且吸附量隨著PAA鏈羧基含量的增加而提高,因此在PMG/PAG涂層毛細管中PMG/PAG81涂層毛細管(PAA鏈長是PMOXA鏈長的2.2倍)對溶菌酶的吸附量最大。當條件變?yōu)閜H 3時,PMG/PAG涂層毛細管相對熒光強度顯著下降,相對熒光強度下降率接近100%(相對熒光強度下降率:當pH 7變?yōu)閜H 3時同一毛細管吸附FITC-溶菌酶相對熒光強度的下降量與在pH 7時相對熒光強度的百分比),高于相應(yīng)的PAG涂層毛細管(PAG21、PAG48和PAG81涂層毛細管相對熒光強度下降率分別為54.95%、59.82%、80.70%),表明PMG/PAG涂層毛細管將之前吸附的溶菌酶脫附下來,而且脫附率高于相應(yīng)的PAG涂層毛細管。在pH 3時,PAA鏈幾乎不帶電荷而且呈塌縮的狀態(tài),之前吸附的溶菌酶得以釋放;同時,PMOXA鏈暴露在最外層以阻抗溶菌酶進一步吸附[23,28],因此,在PAG與PMG的協(xié)同作用下,PMG/PAG涂層毛細管的蛋白質(zhì)脫附率與相應(yīng)的PAG涂層毛細管相比得到提高。以上結(jié)果表明,雖然裸管、PAG涂層毛細管和PMG/PAG涂層毛細管均可通過改變環(huán)境的pH和I吸附和脫附溶菌酶,但是只有PMG/PAG混合涂層毛細管在一定條件下可達到對溶菌酶的可逆吸附,且PAA鏈長是PMOXA鏈長的2.2倍時(即PMG/PAG81涂層毛細管)對溶菌酶的可控吸附性能最佳。

表 2 裸管和涂層毛細管在線富集法檢測溶菌酶的SEF值

2.4 毛細管電泳在線富集溶菌酶

上述研究表明PMG/PAG涂層毛細管對溶菌酶的可控吸附可以通過環(huán)境pH及I的變化而實現(xiàn)。將PMG/PAG涂層毛細管應(yīng)用于毛細管電泳在線富集溶菌酶,其在線富集溶菌酶的過程如下:首先用pH 7磷酸鹽緩沖液潤洗PMG/PAG涂層毛細管,此時PAA鏈中羧基發(fā)生解離而帶負電荷,PAA鏈內(nèi)和鏈間產(chǎn)生靜電排斥,導(dǎo)致PAA鏈處于伸展狀態(tài);隨后向毛細管中注入溶菌酶溶液,帶正電荷的溶菌酶通過靜電吸引作用吸附在帶負電荷的PAA鏈上;之后注入pH 3磷酸鹽緩沖液,PAA鏈中羧基解離程度顯著下降,PAA鏈幾乎不帶電荷而且呈塌縮構(gòu)象,導(dǎo)致溶菌酶與PAA鏈之間的靜電吸引作用下降,溶菌酶從管壁上脫附下來,同時暴露在最外層的PMOXA鏈可以阻抗溶菌酶進一步吸附;最后施加電壓,脫附的溶菌酶快速遷移至檢測器,整個過程可以提高溶菌酶的瞬時濃度,因此檢測信號得以放大。圖5為裸管和涂層毛細管分別在普通電泳法及在線富集法下檢測溶菌酶的電泳圖,相應(yīng)的SEF值見表2。

圖 5 不同毛細管檢測溶菌酶的電泳圖Fig. 5 Electropherograms of lysozyme detection using different capillaries

裸管的SEF值為7.11,表明使用裸管通過在線富集法可以富集溶菌酶,增強溶菌酶信號檢測靈敏度。在pH 7條件下裸管內(nèi)壁帶有負電荷(由圖3可知),帶正電荷的溶菌酶通過靜電吸引作用吸附在裸管內(nèi)壁上,注入pH 3磷酸鹽緩沖液后,溶菌酶與裸管內(nèi)壁之間的靜電吸引作用由于裸管內(nèi)壁所帶負電荷的減少而降低,溶菌酶從裸管內(nèi)壁上脫附下來(由圖4可知),最后施加電壓,脫附的溶菌酶遷移至檢測窗口,整個過程可以提高溶菌酶的瞬時濃度。由表2可知,在PAG涂層毛細管中隨著PAA理論鏈長由5.28 nm(PAG21涂層毛細管)增加至20.37 nm(PAG81涂層毛細管), SEF值由7.47提高至12.62,這是由于隨著PAA鏈長的增加,涂層中羧基含量增大,PAG涂層毛細管對溶菌酶的可控吸附性能提高,因此可以富集更多的溶菌酶。PMG/PAG涂層毛細管與PAG涂層毛細管具有相同的規(guī)律,即PMG/PAG涂層毛細管的SEF值隨著PAA理論鏈長的增加而提高。值得注意的是,在PAA理論鏈長相同的情況下,PMG/PAG涂層毛細管的SEF值高于PAG涂層毛細管的SEF值。PMG/PAG涂層結(jié)合了PMOXA的抗蛋白質(zhì)吸附性能和PAA的刺激響應(yīng)性,與PAG涂層毛細管相比,PMG/PAG涂層毛細管可進一步增加溶菌酶的瞬時濃度,提高在線富集效果?？傊?使用裸管、PAG涂層毛細管和PMG/PAG涂層毛細管通過在線富集法可有效富集溶菌酶,增強溶菌酶信號檢測靈敏度,其中,PMG/PAG81涂層毛細管(PAA鏈長為PMOXA鏈長2.2倍)的SEF值最大,說明該涂層毛細管具有最佳的在線富集效果,其檢測信號強度是普通電泳法檢測信號的17.69倍。

2.5 方法學(xué)評價

使用PMG/PAG81涂層毛細管通過在線富集法檢測溶菌酶,以溶菌酶的質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性擬合。結(jié)果表明,溶菌酶的電泳峰面積與質(zhì)量濃度在3.0×10-4～7.5×10-3g/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 0。通過3倍信噪比(S/N)得到溶菌酶的檢出限(LOD)為8.7×10-5g/L。

為考察在線富集法的精密度,用同一根PMG/PAG81涂層毛細管在同一天內(nèi)對溶菌酶連續(xù)測定5次以及連續(xù)測定5天。峰面積的日內(nèi)、日間相對標準偏差(RSD)分別為2.9%和4.1%,遷移時間的日內(nèi)、日間RSD分別為0.9%和2.1%,表明該方法的重復(fù)性和毛細管涂層的穩(wěn)定性良好。涂層的穩(wěn)定性歸因于聚合物與毛細管內(nèi)壁之間形成了穩(wěn)定的共價鍵,即在加熱的條件下,PMG和PAG中環(huán)氧基團與毛細管內(nèi)壁上的硅羥基發(fā)生化學(xué)反應(yīng),將PMG和PAG共價鍵合在毛細管內(nèi)壁,形成了牢固的涂層,同時GMA間的自交聯(lián)反應(yīng)進一步加強了涂層的穩(wěn)定性。因此,與非共價鍵涂層[37]相比,該涂層更加穩(wěn)定不易脫落,同時與其他共價鍵合涂層相比,該涂層的制備過程簡單,只需要一步即可制得。

3 結(jié)論

本文通過一步加熱法利用GMA中環(huán)氧基團與毛細管內(nèi)壁硅羥基之間的化學(xué)反應(yīng),將PMOXA-r-GMA和PAA-b-PGMA共價鍵合在毛細管內(nèi)壁,制備出基于PMOXA和PAA的混合刷涂層毛細管。該涂層結(jié)合了PMOXA的抗蛋白質(zhì)吸附性能和PAA的刺激響應(yīng)性,通過改變環(huán)境的pH和I可對溶菌酶的吸附和脫附實現(xiàn)調(diào)控,從而用于毛細管電泳在線富集溶菌酶。當PAA鏈長是PMOXA鏈長2.2倍時,混合刷涂層毛細管具有最佳的在線富集效果,其檢測信號強度是普通電泳法檢測信號的17.69倍,LOD為8.7×10-5g/L。該研究為提高蛋白質(zhì)的檢測靈敏度提供了簡單有效的方法。