孟慶威, 郭 磊, 謝劍煒

(1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100850;2. 東曜藥業(yè)有限公司, 江蘇 蘇州 215024)

核酸適配體是一類通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)得到的單鏈寡核苷酸(RNA或單鏈DNA, ssDNA),是分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一類重要的“明星分子”,在分析傳感、治療藥物、臨床診斷等方面開展了多樣化探索實(shí)踐[1]。與抗體抗原親和識(shí)別方式比較,相似的是,適配體與靶分子間亦具備空間互補(bǔ)之特征,經(jīng)多種靜電、疏水等作用力產(chǎn)生特異性識(shí)別;不同的是,適配體作為寡核苷酸分子本身,存在結(jié)構(gòu)易變性、多樣性,其三維結(jié)構(gòu)受體系微環(huán)境,如界面特性、溶液離子種類/濃度等調(diào)控的影響較為顯著,某種程度上對(duì)適配體的具體應(yīng)用造成了一定阻礙[2]。目前認(rèn)為,對(duì)于適配體及其靶分子,最好利用至少兩種方法進(jìn)行相互作用評(píng)價(jià),以深入理解其作用方式及特性。

目前常見的互作評(píng)價(jià)技術(shù)包括熒光、凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析、CE、等溫滴定量熱法、表面等離子體共振等[3,4],其中CE技術(shù)因其多模式方法、體系生物相容性強(qiáng)的特點(diǎn),已成功發(fā)展了親和CE(ACE)、CE-前沿分析(FA)、預(yù)平衡-毛細(xì)管區(qū)帶電泳(PE-CZE)等多種評(píng)價(jià)方法[5,6]。例如,近年來(lái)Krylov課題組[7,8]發(fā)展了一系列動(dòng)力學(xué)CE方法,從CE分離狀態(tài)中的復(fù)合物形成和解離的偏微分方程解析解入手,可針對(duì)單張譜圖,從平衡混合物的非平衡CE(NECEEM,也即PE-CZE)[9]、柱塞-柱塞動(dòng)力學(xué)CE[10]等多種模式同時(shí)求解解離常數(shù)(Kd)和動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)。一般認(rèn)為CE-FA適用于測(cè)定快解離的結(jié)合過(guò)程,而PE-CZE適用于慢解離(解離動(dòng)力學(xué)低于CE中的峰分離時(shí)間量度)的結(jié)合過(guò)程。但亦有PE-CZE研究快解離[11]、微流控芯片CE-FA研究慢解離[12]的結(jié)合作用的報(bào)道。

CE技術(shù)本質(zhì)上是高壓電場(chǎng)下的分離技術(shù),適配體-靶分子復(fù)合物在分離過(guò)程中不斷發(fā)生解離;另外,適配體是結(jié)構(gòu)柔性分子,其與靶蛋白的結(jié)合易受體系微環(huán)境影響,最終造成多種CE互作評(píng)價(jià)體系測(cè)定的Kd結(jié)果存在明顯差異。例如,對(duì)于凝血酶及其特異性作用于肝素結(jié)合位點(diǎn)的29mer ssDNA適配體(Kd經(jīng)硝酸纖維素膜過(guò)濾法測(cè)定為0.5 nmol/L[13]),本課題組前期使用PE-CZE測(cè)得Kd值為200～255 nmol/L[14];張新祥課題組使用PE-CZE結(jié)合化學(xué)發(fā)光測(cè)得Kd為124±7 nmol/L[15]; Riley等使用毛細(xì)管等速電泳,以NECEEM計(jì)算29mer與凝血酶的Kd為128±9 nmol/L[16]; Gong等應(yīng)用芯片ACE測(cè)得Kd值為43 nmol/L[17]等。這就使得基于CE的互作評(píng)價(jià)方法的可靠性受到限制。甚或2019年,Wakui等使用磁珠輔助CE體外篩選得到Kd值為4.5～8.2 nmol/L的數(shù)種凝血酶適配體,但反而選用表面等離子體共振對(duì)其親合力進(jìn)行評(píng)價(jià)[18]。

因此,亟須科學(xué)設(shè)計(jì)和系統(tǒng)比較,針對(duì)同一體系使用多種CE方法表征測(cè)定適配體-靶分子間親和作用,從而有效說(shuō)明CE方法的適用性。本研究即針對(duì)該29mer-凝血酶親和作用為模型體系,使用CE-激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測(cè),引入CE-FA評(píng)價(jià)方法,并比較其與PE-CZE的異同,進(jìn)而經(jīng)多種方式進(jìn)行Kd擬合,詳細(xì)討論了兩種方法下6種方式的擬合結(jié)果及適用范圍,以實(shí)現(xiàn)優(yōu)選與比較印證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE 5000型毛細(xì)管電泳儀,配備激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(氬離子激光器,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)520 nm),液冷控溫模式(美國(guó)Beckman公司); 32 Karat儀器控制與數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)Beckman公司);未涂層熔融石英毛細(xì)管(河北永年光纖廠)。

人α-凝血酶(8.3 mg/mL,活性3 432 Units/mg,美國(guó)Haematologic Technologies公司); 5′端熒光素標(biāo)記的凝血酶適配體F29mer(5′-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3′,上海生工生物技術(shù)公司,經(jīng)UltraPAGE或HPLC純化);牛血清白蛋白(BSA,北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris,美國(guó)Angus公司);甘氨酸(上海生工生物技術(shù)公司); NaOH、甲醇(國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司),所有試劑純度至少為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分離毛細(xì)管的總長(zhǎng)度為37 cm,其中有效分離長(zhǎng)度30 cm,內(nèi)徑為50 μm。新毛細(xì)管使用前以甲醇、水和1 mol/L NaOH分別沖洗10、5和30 min進(jìn)行活化。每天實(shí)驗(yàn)前,毛細(xì)管分別用0.5 mol/L NaOH、H2O和運(yùn)行緩沖液各沖洗5 min。每次分離間用0.5 mol/L NaOH、H2O及電泳緩沖液分別沖洗2、1和3 min。氣動(dòng)進(jìn)樣:0.5 psi(3 447 Pa),分離電壓:15 kV,分離溫度:15 ℃,數(shù)據(jù)采集頻率:5 Hz。運(yùn)行緩沖液:Tris-甘氨酸緩沖液(2×TG,內(nèi)含50 mmol/L Tris、384 mmol/L甘氨酸,pH 8.5)。

CE-FA法中,(1)進(jìn)樣分離的樣品中含終濃度200 nmol/L的凝血酶和終濃度為10～200 nmol/L的F29mer,同時(shí)以F29mer濃度對(duì)平臺(tái)峰高繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,非線性回歸(公式1)測(cè)定Kd值:

(1)

其中,n:結(jié)合比;K:結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù),與Kd互為倒數(shù)關(guān)系;Cf:游離適配體濃度;Cb:結(jié)合適配體濃度;R=Cf/Cb,游離適配體與結(jié)合適配體的比值。

(2)進(jìn)樣分離的樣品中含終濃度100 nmol/L的F29mer和終濃度為0～400 nmol/L的凝血酶,同時(shí)以F29mer平臺(tái)峰的降低及F29mer-凝血酶復(fù)合物平臺(tái)峰的升高進(jìn)行Kd值的非線性擬合(單點(diǎn)結(jié)合模型,公式2)。

(2)

其中,Bmax:特異結(jié)合的F29mer或凝血酶的最大濃度;y: F29mer-凝血酶復(fù)合物峰高或游離F29mer峰高,x:加入的凝血酶濃度,Kd: F29mer-凝血酶復(fù)合物的解離常數(shù)。

PE-CZE法中,(1)進(jìn)樣分離的樣品中含終濃度100 nmol/L的F29mer和終濃度為0～400 nmol/L的凝血酶,以F29mer譜峰的降低及F29mer-凝血酶復(fù)合物譜峰的升高進(jìn)行Kd值的非線性擬合(公式2)。

圖 1 CE-FA分離條件的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of capillary electrophoresis-frontal analysis (CE-FA) separation conditions a. injection time; b. separation voltage; c. added amount of bovine serum albumin (BSA). A: free F29mer; C*: complex peak; mRFU: milli- of relative fluorescence unit.

(2)對(duì)于部分PE-CZE譜圖,采用NECEEM方法計(jì)算Kd(公式3)。

(3)

其中,P0:凝血酶的初始濃度;L0: F29mer的初始濃度;Aa:游離F29mer的峰面積;Ab:兩峰間延伸的橋面積;Ac: F29mer-凝血酶復(fù)合物的峰面積。

所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均重復(fù)測(cè)定3次,取平均值進(jìn)行計(jì)算擬合。所有擬合使用OriginPro 2016軟件(美國(guó)OriginPro公司)進(jìn)行;組間數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA, Graphpad Prism 8,美國(guó)Graphpad Software公司)進(jìn)行顯著性比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 CE-FA

CE-FA方法研究靶蛋白-適配體分子互作的前提條件是,使用系列濃度的適配體與靶蛋白,通過(guò)氣動(dòng)或電動(dòng)進(jìn)樣引入一段較長(zhǎng)的預(yù)平衡混合物區(qū)帶,分離過(guò)程中,復(fù)合物和游離適配體間的淌度存在明顯差異,但復(fù)合物分子和蛋白質(zhì)分子的淌度一致,否則需要淌度校正[19];僅游離適配體和復(fù)合物分離開來(lái),并形成無(wú)彌散的平臺(tái)峰;以及適配體平臺(tái)峰的峰高與游離濃度呈線性關(guān)系。目前常在繪制游離適配體的標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上,經(jīng)結(jié)合適配體/游離適配體濃度比(R)對(duì)游離適配體濃度(Cf)非線性擬合,即給出Kd值和結(jié)合比等[12]。

2.1.1CE-FA分離條件優(yōu)化

本研究使用CE-LIF檢測(cè),未標(biāo)記的凝血酶不能被觀測(cè)到,其對(duì)熒光標(biāo)記適配體(F29mer)和其復(fù)合物峰的檢測(cè)不產(chǎn)生明顯干擾。選用較低工作溫度(15 ℃)、較短毛細(xì)管長(zhǎng)度及生物相容性較好的緩沖體系2×TG(pH 8.5)[14],在37 ℃經(jīng)0.5 h孵育完全后進(jìn)樣。進(jìn)樣時(shí)間30 s,即進(jìn)樣長(zhǎng)度約為毛細(xì)管總長(zhǎng)的11%,得到了穩(wěn)定的復(fù)合物及游離適配體平臺(tái)峰,說(shuō)明在該條件下F29mer-凝血酶復(fù)合物在高壓電場(chǎng)分離時(shí)仍能穩(wěn)定存在。8～15 kV工作電壓時(shí),復(fù)合物及游離適配體的平臺(tái)峰高均可正常維持且基本不變,說(shuō)明CE-FA法的平臺(tái)峰高基本不受工作電壓的影響。加入1 g/L BSA可提高CE-FA分離的重復(fù)性,同一樣品的遷移時(shí)間重現(xiàn)性極好,且平臺(tái)峰高偏差<2%(見圖1)。在該分離條件下,凝血酶(相對(duì)分子質(zhì)量約36 700,等電點(diǎn)7.02)和復(fù)合物并不能形成有效分離,非常符合CE-FA法的前提條件。

2.1.2CE-FA法測(cè)定F29mer-凝血酶結(jié)合作用

CE-FA測(cè)定中,首先以F29mer標(biāo)準(zhǔn)溶液的平臺(tái)峰峰高(Y, mRFU)對(duì)濃度(X, nmol/L)作圖,得到良好的線性關(guān)系(Y=0.126X+1.915),線性范圍為5～200 nmol/L,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.994(n=7),峰高重現(xiàn)性良好(RSD為2.73%)。

圖 2 F29mer-凝血酶相互作用的(a)CE-FA譜圖及(b)R-Cf非線性擬合Fig. 2 (a) CE-FA electrophoregrams of F29mer-thrombin interaction and (b) non-linear fitting by R versus Cf values Cf refers to free aptamer concentration, and R refers to ratio of Cf to the binding aptamer concentration (Cb).

然后固定凝血酶為200 nmol/L,加入終濃度為10～200 nmol/L的F29mer,開展CE-FA測(cè)定(見圖2a)。隨著F29mer濃度增加,游離F29mer的平臺(tái)峰高明顯降低,復(fù)合物的平臺(tái)峰高逐漸增高。將上述不同濃度樣品經(jīng)CE-FA分離后得到的F29mer平臺(tái)峰高的值,代入F29mer的線性方程中,得到對(duì)應(yīng)不同濃度樣品的游離F29mer濃度Cf。

運(yùn)用非線性回歸(公式1)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,求解出相互作用參數(shù),即F29mer與凝血酶間的Kd值為42±28 nmol/L(結(jié)合常數(shù)K為(2.4±0.9)×107L/mol,r2=0.834),n=0.768,取n=1,即1分子的F29mer與1分子的凝血酶結(jié)合。以往CE-FA法中,除非線性擬合外,常對(duì)所得到的系列Cf、Cb、R值等,采用如Scatchard線性回歸(R/Cf對(duì)R作圖)和Klotz線性回歸(1/R對(duì)1/Cf作圖)等進(jìn)一步進(jìn)行線性變換,從而得到Kd值?？紤]到線性變換實(shí)際上是非線性擬合的特殊表現(xiàn)形式,且在線性轉(zhuǎn)換時(shí)往往錯(cuò)誤估計(jì)了實(shí)驗(yàn)誤差的貢獻(xiàn)大小[20],在此不再進(jìn)行線性變換。

圖 3 由(a)CE-FA法的平臺(tái)峰高變化和(b)PE-CZE法譜峰峰高變化對(duì)凝血酶濃度進(jìn)行非線性擬合Fig. 3 Non-linear fitting curves of (a) plateau peak height in CE-FA and (b) peak height in preequilibrium-capillary zone electrophoresis (PE-CZE) versus concentration of thrombin A refers to the relative decrease of (plateau) peak height of free F29mer; C* refers to the relative increase of (plateau) peak height.

另行固定F29mer為100 nmol/L,加入終濃度為5～400 nmol/L的凝血酶,經(jīng)CE-FA分離分析。同樣,隨著凝血酶濃度增加,游離F29mer峰高明顯降低,復(fù)合物峰高明顯升高。針對(duì)該系列濃度樣品所得到的不同復(fù)合物和游離F29mer平臺(tái)峰高值,直接使用游離F29mer平臺(tái)峰高降低值或復(fù)合物平臺(tái)峰高升高值,對(duì)凝血酶濃度進(jìn)行非線性擬合(公式2,見圖3a),得到的Kd值列于表1。

2.2 PE-CZE

2.2.1PE-CZE法測(cè)定F29mer-凝血酶結(jié)合作用

在PE-CZE模式下(進(jìn)樣10 s),游離F29mer和復(fù)合物呈現(xiàn)尖銳的高斯峰,同樣使用游離F29mer峰高降低值或復(fù)合物峰高升高值,對(duì)凝血酶濃度進(jìn)行非線性擬合(公式2,見圖3b)。得到的Kd值列于表1。

表 1 CE-FA與PE-CZE方法下F29mer-凝血酶親和作用參數(shù)

圖 4 PE-CZE模式下用于NECEEM法計(jì)算的峰-橋曲線Fig. 4 Peak-bridge curves calculated by non-equilibrium CE of equilibrium mixtures (NECEEM) in PE-CZE mode

2.2.2應(yīng)用NECEEM法計(jì)算Kd

亦針對(duì)PE-CZE法中單個(gè)濃度下的譜圖,開展了NECEEM法的計(jì)算求解。典型的NECEEM電泳圖由兩個(gè)峰和兩個(gè)峰之間平滑過(guò)渡的“指數(shù)型橋”組成,通常利用峰和橋的面積,經(jīng)公式3計(jì)算得到Kd。2011年,Cherney等[21]經(jīng)過(guò)系統(tǒng)分析后指出,實(shí)驗(yàn)計(jì)算的解離速率常數(shù)(koff)和Kd值與模擬電泳圖計(jì)算值的偏差不會(huì)超過(guò)15%,只需從視覺(jué)上識(shí)別出峰和橋,即可認(rèn)為是合理邊界。屈峰課題組進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)[22]。本研究也采用設(shè)定峰高閾值后自動(dòng)積分的方式,不考慮面積積分帶來(lái)的誤差。當(dāng)F29mer固定為100 nmol/L時(shí),選擇適配體1/2～2倍濃度的靶蛋白共存時(shí)的譜圖進(jìn)行計(jì)算(見圖4)?？梢钥闯?此時(shí)的“指數(shù)橋”部分相對(duì)均較為明顯。凝血酶濃度為50、75、100、200 nmol/L時(shí),所對(duì)應(yīng)單個(gè)譜圖計(jì)算得到的Kd值分別為72、33、36和82 nmol/L,平均值為56±25 nmol/L。

2.3 多種擬合方式的比較

以上不同擬合方式下測(cè)定的F29mer-凝血酶的Kd值均列于表1。所有擬合值經(jīng)one-way ANOVA單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),除PE-CZE(A)給出的Kd(147±63 nmol/L)與其他數(shù)值間存在顯著性差異(P> 0.05)外,其他Kd值均居于24～64 nmol/L間,不存在顯著性差異,即結(jié)果間較為一致。這也說(shuō)明了CE-FA法在本體系中的適用性。

對(duì)于本模型體系,CE-FA法與PE-CZE法相比,其區(qū)別僅在于進(jìn)樣量不同,但峰形上產(chǎn)生了明顯差異。在高壓電場(chǎng)下,CE-FA法中復(fù)合物平臺(tái)峰中始終維持著較穩(wěn)定的結(jié)合平衡;而PE-CZE法中,復(fù)合物峰更傾向于解離,即游離適配體的濃度被高估,那么由PE-CZE (A)給出的Kd值就會(huì)偏高,甚至與其他方式所測(cè)定的Kd值間產(chǎn)生顯著性差異。CE-FA法的平臺(tái)峰高基本不受遷移時(shí)間、電滲流及工作電壓的影響,相對(duì)PE-CZE法而言較為穩(wěn)定,耐用性較強(qiáng)。CE-FA法中的3種擬合方式符合度較好,其中以CE-FA法中依據(jù)平臺(tái)峰高對(duì)分析物濃度變化的非線性擬合更為簡(jiǎn)便。然而,R-Cf非線性擬合方式還可給出對(duì)于同一結(jié)合位點(diǎn)的分子結(jié)合比,但需保證游離適配體標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度較高。

PE-CZE法中的單張譜圖還可經(jīng)NECEEM法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算處理,但尚需選擇適配體的適當(dāng)濃度范圍。例如,Kanoatov等[23]曾指出,如果靶物質(zhì)T和配體L的初始濃度(T0和L0)選擇不當(dāng),極可能造成Kd值的較大誤差,一般推薦L0≤2Kd,Kd+0.5L0≤T0≤2Kd。這就為未知Kd的互作體系帶來(lái)了較大的不確定性。在此選擇凝血酶的濃度為F29mer的0.5～2倍,且觀察到明顯的兩峰間“指數(shù)橋”為前提,多點(diǎn)擬合后取均值,有效規(guī)避了Kd值未知的問(wèn)題。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)目前CE在適配體-靶蛋白親和作用評(píng)價(jià)表征時(shí)存在的差異性,基于F29mer-凝血酶體系引入CE-FA方法,并開展了同一體系條件下的CE-FA及PE-CZE方法及不同擬合模式比較的系統(tǒng)研究?？傮w而言,在確保適配體-靶蛋白復(fù)合物穩(wěn)定存在的前提下,CE-FA法可與PE-CZE互為印證,提高了親和作用評(píng)價(jià)的可靠性。結(jié)合本模型體系,我們提出,在CE親和評(píng)價(jià)時(shí),首選推薦使用多濃度平臺(tái)峰高變化進(jìn)行非線性擬合的CE-FA法,可相對(duì)有效克服對(duì)高壓電場(chǎng)對(duì)復(fù)合物分離的影響,具有適用范圍廣、方法穩(wěn)定、擬合結(jié)果簡(jiǎn)便準(zhǔn)確等特點(diǎn)。未來(lái)可結(jié)合電動(dòng)與氣動(dòng)雙分離模式,提高CE-FA體系對(duì)生理緩沖體系高離子強(qiáng)度的耐受性,使得Kd擬合的準(zhǔn)確度進(jìn)一步增強(qiáng)。