張偉為, 應(yīng)佚倫, 龍億濤,*

(1. 華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 上海 200237;2. 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 生命分析化學(xué)國家重點實驗室, 江蘇 南京 210023)

電泳是指帶電粒子在外加電場作用下以一定速度向電荷相反方向遷移運動的現(xiàn)象[1]?；旌衔镏蟹治鑫锏碾姾闪?、分子大小、形狀等不同,其在外加電場下的泳動速度也不同,從而實現(xiàn)混合物的分離[2-4]。以毛細管電泳為例,其以石英毛細管為分離通道,以高壓直流電場為主要推動力。毛細管的內(nèi)徑通常為25～100 μm,長度一般為20～100 cm,由于其比表面積大,易于散熱,故可承受電場高達1 000 V/cm。毛細管內(nèi)壁界面的特殊結(jié)構(gòu)產(chǎn)生雙電層效應(yīng),使得待測物分子同時受到電滲流和電泳力的共同作用。待測分子在如此高的電場強度下,經(jīng)過一個幾十厘米長的毛細管道,分子之間運動的相對速度差異將更加明顯,從而使毛細管電泳的分離效率、分離能力相比于傳統(tǒng)電泳顯著提高。

若將毛細管的長度縮短,同時內(nèi)徑也進一步縮小,達到納米尺度,則其孔道內(nèi)限域空間將與單個待測分子尺寸相匹配,在外加電場下,可達到極高的電場強度,有望實現(xiàn)單分子水平上的電泳分離。例如,將毛細管長度縮短為10 nm,孔徑縮小為1 nm,這種獨特的限域空間,極大地增強了毛細管內(nèi)電動力行為,僅需100 mV的施加電壓,即可達到約100 kV/cm的超高電場強度。在這樣的電化學(xué)限域空間內(nèi),就可以實現(xiàn)單分子水平上的分離分析,如可以分析識別單個堿基長度[5,6]、單個氨基酸差異[7],乃至單核苷酸甲基化[8]。為實現(xiàn)“單分子電泳”這一想法,亟須設(shè)計構(gòu)建與單個分子尺寸匹配的分離測量界面。天然生物孔道蛋白,如Aerolysin[9-11],α-Hemolysin[12-14]等,其由一個蛋白質(zhì)分子組成的限域孔道界面與單個生物分子如DNA,多肽等尺寸類似,且其孔道內(nèi)壁可以看作是由氨基酸組成的具有調(diào)控電遷移能力的特異性孔道界面。在電場力的作用下,單個待測分子逐一進入生物納米孔道內(nèi)部,孔道內(nèi)的每一個氨基酸殘基都相當于一個傳感基元,待測物分子逐一穿過納米孔道時會與內(nèi)壁多個氨基酸殘基發(fā)生時序性地相互作用。相互作用方式、程度與時長具有單分子特性,從而使得每一個待測分子在生物納米孔道內(nèi)的特征遷移速度和遷移運動軌跡不同,形成特征離子流阻斷信號。每秒可以有上千個分子穿過孔道,通過對其進行統(tǒng)計分析,讀取每一個離子流阻斷信號的阻斷電流、阻斷時間、阻斷頻率以及信號特征,可以從單分子電泳水平對單個生物分子實現(xiàn)高通量的分辨與識別[15]。

納米孔道技術(shù)是基于80年代人們受到的流式細胞儀的啟發(fā)而提出的用單分子進行DNA測序的思想而發(fā)展起來的一種單分子分析技術(shù)[16]。在接下來的近10年里,研究者一直在尋找合適的界面材料,即只能允許單鏈DNA通過,而不能允許雙鏈DNA通過的界面材料,直到α-Hemolysin的出現(xiàn)才正式讓人看到這一設(shè)想可能變成現(xiàn)實的希望[12,17-21],由于分子穿過孔道的速度特別快,當時還難以準確捕獲DNA穿孔過程中的單個堿基序列信息。隨著對孔道分辨能力的提高以及對儀器設(shè)備的不斷更新,經(jīng)過20多年的科研投入,已研究出采用納米孔道技術(shù)進行核酸測序的儀器并且實現(xiàn)商品化,進一步應(yīng)用于新冠病毒核酸的檢測,大幅提升了病毒陽性檢出率[22]。

本文基于Aerolysin生物納米孔道構(gòu)建了“單分子電泳”分離體系,應(yīng)用其實現(xiàn)了對僅有一個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸差異的寡聚核苷酸分子5′-CAA-3′(CA2)、5′-CAAA-3′(CA3)、5′-CAAAA-3′(CA4)的分離識別,從電泳角度重新認識和理解了納米孔道電化學(xué)單分子分析技術(shù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

納米孔道檢測池(Warner Instruments公司,美國); ChemClamp電流放大器(Dagan Corporation公司,美國); Digidata1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon Instruments公司,美國); Clampex 10.3數(shù)據(jù)記錄軟件(Axon Instruments公司,美國)[5,23,24]。

實驗所用溶液均采用超純水(其電導(dǎo)率為18 MΩ/cm, 25 ℃)進行配制。Aerolysin蛋白通過大腸桿菌體系表達純化所得;實驗所用磷脂1,2-二植烷?；字?1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 200 mg)購自Avanti Polar Lipids公司(美國);正癸烷購自Sigma-Aldrich公司(美國);乙二胺四乙酸(EDTA, ≥99.995%)和三羥甲基氨基甲烷(Tris, ≥99%)購自阿拉丁(中國);氯化鉀(KCl, ≥99.0%)購買Sigma-aldrich公司(美國);單鏈DNA均購自生物工程有限公司(中國),本研究所涉及DNA片段均在5′端不含磷酸基團[5,23,24]。實驗所用直徑為1.0 mm的銀絲購自Alfa Aesar公司(英國),本實驗采用電鍍法進行Ag/AgCl電極的制備。

1.2 納米孔道檢測體系的構(gòu)建

如圖1a所示,兩個檢測池緊緊地組裝在一起,分別盛有1.0 mL的電解質(zhì)溶液(1.0 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris, 1.0 mmol/L EDTA, pH=8.0),其相連接處隔板中央有一個約50 μm的小孔可以將其連通,兩檢測池通過一對Ag/AgCl電極施加電壓構(gòu)成電化學(xué)回路。通過筆刷蘸取一定濃度的磷脂正癸烷溶液,在連通兩檢測池的小孔處構(gòu)建一層磷脂雙分子層膜,此時兩檢測池被完全阻斷,電流趨于0。在本研究中定義:接通電源負極的一端為cis端,正極的一端為trans端,在cis端溶液中加入一定濃度的Aerolysin蛋白,在施加電壓(200～350 mV)條件下,Aerolysin蛋白單體在磷脂雙分子層膜上自組裝為單個孔徑約為1 nm,直徑約為10 nm的七聚體生物納米孔道,成為兩檢測池的唯一通道。如圖1b所示,此時連通兩檢測池的孔徑由50 μm減小到1 nm。當獲得穩(wěn)定的單個Aerolysin納米孔通道時,在100 mV的施加電壓下可產(chǎn)生約50 pA的開孔電流。

圖 1 (a)納米孔道電化學(xué)單分子分析技術(shù)原理圖及(b) Aerolysin生物納米孔道分離識別CA2、CA3、CA4Fig. 1 Illustration of (a) the nanopore electrochemical measurement and (b) discrimination of CA2, CA3 and CA4 by an Aerolysin nanoporeCA2: 5′-CAA-3′; CA3: 5′-CAAA-3′; CA4: 5′-CAAAA-3′; A/D convertor: analog-digital convertor.

1.3 分析物檢測

在獲得穩(wěn)定的Aerolysin納米孔道之后,在cis端溶液中加入待測物分子。在電泳力和電滲流的共同作用下,待測分子從cis端溶液穿過孔道到trans端溶液中,穿孔過程中會因體積排阻效應(yīng)排開孔道內(nèi)的部分電解質(zhì)離子,從而使電流幅值下降,并且待測物分子穿孔過程中與孔道內(nèi)壁的氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用,導(dǎo)致離子流呈現(xiàn)特征性變化。這些離子流信號由放大器放大,通過模數(shù)轉(zhuǎn)化器轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號并記錄。不同分子穿過納米孔道時會引起不同阻斷程度、阻斷時間、阻斷頻率、阻斷形狀的離子流信號。通過對每一個阻斷電流信號進行統(tǒng)計分析,可以獲取單個待測物的成分、結(jié)構(gòu)、尺寸、濃度、電性等信息。

本文的待測物是一組僅有一個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸長度差異的寡聚核苷酸,分別為CA2、CA3、CA4。在cis端溶液中加入預(yù)混后的上述3種待測物分子,施加80 mV,實現(xiàn)實時監(jiān)測3種不同的分子穿過Aerolysin納米孔道的特征離子流信號。

2 結(jié)果與討論

本實驗中所采用的緩沖體系為pH=8弱堿性環(huán)境,可使核苷酸的磷酸基團發(fā)生電離。因此,每個磷酸基團都將帶有一個負電荷,CA2、CA3、CA4分別帶有2、3、4個負電荷。由于Aerolysin納米孔道孔徑僅為1 nm,孔長僅為10 nm,故80 mV的施加電壓即可造成約80 kV/cm的電場強度。帶有不同電荷的CA2、CA3、CA4分子在孔道內(nèi)將受到不同大小的電泳力,由cis端溶液遷移到trans端溶液中。由于Aerolysin納米孔道對陰離子具有選擇性,通過納米孔道的電滲流方向與陰離子流動方向一致,故在Aerolysin納米孔道中電滲流的方向也是由cis端到trans端[7]。所以,單個CA2、CA3、CA4分子在電泳力和電滲流共同作用的驅(qū)動下穿過單個Aerolysin納米孔道。由于待測分子的帶電荷量不同、分子尺寸不同,將會造成分子的遷移速度不同,導(dǎo)致分子的過孔持續(xù)時間不同,即電流阻斷信號的阻斷時間不同。此外,單個分子在納米孔道限域空間內(nèi)產(chǎn)生的離子流體積排阻大小不同，使得單個分子電流阻斷信號具有特征阻斷程度。更重要的是,Aerolysin納米孔道內(nèi)壁界面含有兩處含有極性氨基酸的靈敏區(qū)域[25](見圖1b),其與帶負電荷的分子間具有強烈的靜電相互作用,故而導(dǎo)致單個分子穿孔過程中遷移運動軌跡具有差異,即對電流阻斷信號的阻斷程度和阻斷時間造成影響。

本實驗結(jié)果表明,CA2、CA3、CA4分子在穿過Aerolysin納米孔道時產(chǎn)生了3種阻斷程度具有明顯差別的電流阻斷信號,其阻斷電流值差別約為3～5 pA(見圖2a)?；旌蠘悠纷钄嚯娏骱妥钄鄷r間散點圖具有3個特征分布,分別可對應(yīng)這3種相差一個核苷酸的CA2、CA3、CA4分子穿過Aerolysin納米孔道時所引起的電流變化情況(見圖2b)。此外,散點圖還顯示出不同待測分子與孔道的作用時間也有較大差異,具體表現(xiàn)為CA3、CA4的阻斷時間是CA2阻斷時間的5倍,這表明CA2、CA3、CA4穿孔的遷移速度有較大差異,即待測分子帶電荷量越高,所受電泳力將越強,故而在孔道內(nèi)的遷移速度越高。

圖 2 (a)3種分子穿過Aerolysin納米孔道時產(chǎn)生的原始電流軌跡圖、(b)阻斷時間和阻斷電流的散點圖和(c)阻斷電流直方圖Fig. 2 (a) Continuous raw current traces generated by the three analytes traversing through an Aerolysin nanopore, (b) scatter plots of the duration and residual current (Ires) and (c) histogram of Ires

本研究定義Ires為單個分子在Aerolysin納米孔道內(nèi)時所造成的特征阻斷電流值,對其進行高斯擬合,可以得到3種待測物分子穿過Aerolysin納米孔道時對應(yīng)的特征阻斷電流值,擬合高斯峰電流分別為20.7、15.7、12.7 pA(見圖2c)。本課題組之前的研究表明,位阻效應(yīng)使得長度不超過14個核苷酸的寡聚核苷酸穿過Aerolysin納米孔道時所造成的電流阻斷程度隨鏈長的增加而增加[5,11],即Ires越小,分子的尺寸就越大,據(jù)此可以根據(jù)Ires依次分辨出CA2、CA3、CA43種分子。

3 結(jié)論

本文從電泳技術(shù)的角度重新理解了納米孔道電化學(xué)單分子分析技術(shù),將其看作為納米孔道單分子電泳技術(shù)。這種技術(shù)的特征在于孔道尺寸與分子尺寸相匹配,并且孔道內(nèi)含有多個靈敏位點,分子在電泳力和電滲流的共同作用下逐一進入孔道,與孔道內(nèi)多個靈敏位點發(fā)生有時序性的相互作用。由于分子運動速度、相互作用方式不同,從而產(chǎn)生不同阻斷時長、阻斷程度的特征性離子流信號,對其進行統(tǒng)計分析可以在單分子水平上實現(xiàn)僅有一個核苷酸差異的分辨。根據(jù)待測生物分子的電性和尺寸差異,Aerolysin納米孔道單分子電泳技術(shù)已應(yīng)用于識別檢測僅相差一個凈電荷的多肽序列[15]、DNA及多肽分子的多個磷酸化位點[26,27],以及磷酸酶和激酶的催化活性[26,28]。進一步,通過調(diào)控電解質(zhì)陽離子種類,增強了單個待測分子進入孔道的能力,從而實現(xiàn)對小分子化合物(例如環(huán)二核苷酸)的超靈敏檢測[29]。

生物納米孔道可認為是一個由單個蛋白質(zhì)分子組成的單分子界面,也是一個分離利用效率最高的界面。通過定點突變孔道內(nèi)氨基酸技術(shù)可進一步調(diào)控孔道內(nèi)壁電荷和與待測分子間相互作用[30],從而實現(xiàn)在混合樣品中對帶有同種電荷且電量相同的生物分子進行高靈敏性識別分析。更重要的是,待測分子與納米孔道的相互作用具有時序性信息,結(jié)合微流控、陣列孔技術(shù),未來有望從單分子水平上進行單個分子的分離識別。

致謝 特別感謝“毛細管電動分離分析前瞻研討會”和中科院化學(xué)所陳義研究員在納米孔道電泳理解方面對我們研究的指導(dǎo)和幫助。