趙凌藝, 呂文娟, 牛效瑩, 潘聰潔, 陳宏麗, 陳興國

(蘭州大學化學化工學院, 功能有機分子化學國家重點實驗室, 甘肅 蘭州 730000)

毛細管電色譜(CEC)是一種集成了毛細管電泳高分離效率和高效液相色譜高選擇性的分離技術(shù),具有樣品消耗量低、分析速度快等優(yōu)點[1,2]。開管-毛細管電色譜(OT-CEC)作為CEC的模式之一,雖具有毛細管柱制備簡單、電滲流穩(wěn)定及柱效較高等優(yōu)點[2,3],但其柱容量和相比較低的缺點卻在一定程度上限制了它的發(fā)展[2]。因此,選擇適當?shù)墓潭ㄏ鄟砜朔鲜鋈秉c以提高分離效率成為OT-CEC的研究熱點。近年來,已有較多有關(guān)多孔有機骨架材料用作OT-CEC新型固定相材料的報道[4-15]。

共價有機骨架材料(COFs)作為一種由有機結(jié)構(gòu)單元通過共價鍵連接而成的新型多孔晶體材料[16-18],因其比表面積較大、穩(wěn)定性較高及孔徑易于調(diào)控等優(yōu)點[17,18],在儲氣[19]、催化[20]和吸附[21]等領(lǐng)域得到了廣泛的應用。同時,優(yōu)異的特性和獨特的結(jié)構(gòu)也使得COFs在分析化學中具有巨大的應用潛力[22-25]。迄今為止,已有的研究表明COFs可成功應用在色譜分離[12-15,26,27]和樣品前處理[28-30]中,但其作為固定相用于CEC分離的相關(guān)報道較少[12-15,31,32]。

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)是指在進入人體后會干擾體內(nèi)正常內(nèi)分泌物質(zhì)作用并破壞內(nèi)分泌系統(tǒng)穩(wěn)定性的一大類外源性化合物[33]。研究表明EEDs會造成出生缺陷、人類生育能力降低和生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率增加[34,35]。研究已證實在空氣、水、土壤等介質(zhì)中存在約50～70種EEDs[34]。目前,分離檢測EEDs的方法主要為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[36]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[37],但這些方法存在操作復雜、樣品用量大等問題,因此開發(fā)簡單、高效、樣品用量少的CEC方法用于分離檢測EEDs是十分必要的。

鑒于此,本工作通過共價鍵合的方式將一種二維吖嗪共價有機骨架材料ACOF-1涂覆于毛細管內(nèi)壁,制備了ACOF-1涂層毛細管,以其為分離通道建立了分離硝基苯酚類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的OT-CEC方法,并以4種硝基苯酚作為模型分析物對方法的性能和分離機理進行了評價和研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀(美國Beckman Coulter有限公司);D/max-2400 X射線粉末衍射儀(Rigaku,日本);Nicolet Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet,美國);JSM-6701F場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JEOL,日本)。熔融石英毛細管(內(nèi)徑75 μm,外徑375 μm,河北省永年光導纖維廠)。

水合肼、3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)購自美國Sigma-Aldrich試劑公司。1,4-二氧六環(huán)購自日本東京化成工業(yè)株式會社。乙酸、2-硝基苯酚(2-NP)、4-硝基苯酚(4-NP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)購自上海阿達瑪斯試劑有限公司。甲醇、乙腈、丙酮和甲苯購自天津利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司。上述試劑均為分析純,實驗用水為超純水。

1.2 合成ACOF-1

按文獻[19]報道的合成方法做適當修改后合成ACOF-1:向安瓿瓶中加入60 mg 1,3,5-均苯三甲醛和2.0 mL 1,4-二氧六環(huán),振蕩直至固體粉末溶解。隨后,向混合物中依次加入0.2 mL乙酸水溶液(6 mol/L)和38 μL水合肼。在液氮浴中快速冷凍及真空條件下火焰密封安瓿瓶。將恢復室溫的安瓿瓶放置于烘箱中,120 ℃下反應72 h。反應結(jié)束后立即取出安瓿瓶并趁熱將其從頸部打碎,將混合物轉(zhuǎn)移至離心管中離心分離得到黃色固體。用丙酮洗滌數(shù)次后置于真空烘箱中于25 ℃干燥過夜,即得到淺黃色ACOF-1粉末。

1.3 制備ACOF-1涂層毛細管

首先,依次用甲醇(10 min)、超純水(10 min)和1.0 mol/L NaOH(15 min)沖洗新的熔融石英毛細管,用橡膠塞密封毛細管兩端后放入100 ℃烘箱中加熱2 h。然后,分別用0.5 mol/L HCl(30 min)、超純水(10 min)、甲醇(10 min)和丙酮(10 min)沖洗毛細管,氮氣吹干毛細管并在120 ℃下加熱1 h。之后,在預處理過的毛細管中充滿GLYMO-甲苯(5∶95, v/v)溶液,兩端密封,于100 ℃下加熱6 h后依次用甲苯(10 min)、甲醇(10 min)和丙酮(10 min)沖洗,再用氮氣吹干即得到GLYMO涂覆的毛細管。最后,將ACOF-1的甲醇溶液(1.0 g/L)泵送并充滿GLYMO涂覆的毛細管,兩端密封后在70 ℃下反應4 h。之后,用甲醇和丙酮徹底沖洗,除去殘留的ACOF-1并用氮氣吹干,即得到ACOF-1涂層毛細管。在整個制備過程中,通入溶液時施加于毛細管的壓力均為0.07 MPa。圖1為ACOF-1涂層毛細管的簡要制備過程示意圖。

1.4 緩沖溶液和標準溶液配制

配制0.1 mol/L的硼砂溶液作為緩沖溶液儲備液,使用前用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾,用超純水和有機添加劑(甲醇或乙腈)稀釋并調(diào)節(jié)至適當pH,得到運行緩沖溶液。

使用乙腈為溶劑配制質(zhì)量濃度為4.0 g/L的分析物標準儲備溶液,于4 ℃下儲存。分析前用運行緩沖溶液稀釋得到工作溶液。

1.5 電泳條件

涂層毛細管在首次使用之前,用運行緩沖液沖洗3 min;兩次運行之間,用超純水和運行緩沖液分別沖洗5 min。工作溶液超聲脫氣后通過壓力進樣(3.447 5 kPa)注入毛細管中,進樣時間3 s,分離電壓為-23 kV,運行緩沖溶液為15 mmol/L硼砂緩沖液(含10%(v/v)甲醇,pH 9.20),紫外檢測波長為214 nm,毛細管溫度為25 ℃。

圖 1 ACOF-1涂層毛細管的制備示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the preparation of the ACOF-1 coated capillary

2 結(jié)果與討論

2.1 ACOF-1的合成和ACOF-1涂層毛細管的制備

原文獻[19]合成方法的試劑加入順序依次為1,3,5-均苯三甲醛、水合肼、1,4-二氧六環(huán)、乙酸。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):若最后加入水合肼,所得產(chǎn)物的X射線粉末衍射特征峰強度更高。為了使所合成的ACOF-1的晶型更好,本實驗將試劑加入順序調(diào)整為1,3,5-均苯三甲醛、1,4-二氧六環(huán)、乙酸、水合肼。制備涂層管時,利用GLYMO作為硅烷偶聯(lián)劑將環(huán)氧基修飾在毛細管內(nèi)壁上。之后引入ACOF-1,借助環(huán)氧基開環(huán)并與ACOF-1中氨基的反應[38]將ACOF-1固定在毛細管內(nèi)壁。

圖 2 (a)合成的ACOF-1的XRD譜圖與(b)合成的ACOF-1 (Ⅰ)和ACOF-1涂層毛細管(Ⅱ)的紅外光譜圖 Fig. 2 (a) X-ray powder diffraction (XRD) pattern of the synthesized ACOF-1 and (b) FT-IR spectra of the synthesized ACOF-1 (Ⅰ) and the ACOF-1 coated capillary (Ⅱ)

2.2 ACOF-1和ACOF-1涂層毛細管的表征

2.2.1XRD和FT-IR表征

圖2a為合成的ACOF-1的X射線粉末衍射(XRD)譜圖,其中7.14°、12.31°和27.45°處的衍射峰分別對應于(100), (110)和(001)晶面,這些衍射峰的位置與文獻[19]報道的ACOF-1模擬XRD譜圖中衍射峰位置一致,表明成功合成了ACOF-1。通過傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對合成的ACOF-1和粉碎的ACOF-1涂層毛細管進行了表征,結(jié)果見圖2b。譜圖中802 cm-1和1 099 cm-1處的吸收來源于Si-O-Si的對稱和不對稱拉伸,3 432 cm-1的寬吸收為O-H的伸縮振動,1 617 cm-1及1 627 cm-1處的吸收為C=N的伸縮振動。FT-IR結(jié)果說明成功制備了ACOF-1涂層毛細管。

2.2.2掃描電子顯微鏡表征

利用掃描電子顯微鏡對裸毛細管和ACOF-1涂層毛細管的內(nèi)壁進行表征,以觀察毛細管內(nèi)壁形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。表征結(jié)果顯示裸毛細管的內(nèi)壁非常光滑(見圖3a),而ACOF-1涂層毛細管的內(nèi)壁則變得粗糙并可觀察到涂層材料的分布(見圖3b-d),表明ACOF-1被成功涂覆于毛細管內(nèi)壁。由于ACOF-1涂層的厚度會影響分離效果。為確保涂層厚度一致,實驗通過在制備過程中控制GLYMO和ACOF-1的濃度和通入時間實現(xiàn)這一目的。

圖 3 (a)裸毛細管和(b、c、d) ACOF-1涂層毛細管內(nèi)壁的掃描電鏡圖Fig. 3 Scanning electron micrograph images of (a) the bare capillary and (b, c, d) the ACOF-1 coated capillary

2.3 分離條件的優(yōu)化

2.3.1有機添加劑

向緩沖溶液中加入適量的有機添加劑,可有效提高分析物在緩沖溶液中的溶解度,從而影響分離效率。實驗考察了甲醇、乙腈等常用有機添加劑對分離效率的影響,結(jié)果表明使用甲醇的效果更好。因此后續(xù)實驗選擇甲醇作為有機添加劑并進一步對緩沖溶液中甲醇的含量進行優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果表明在添加10%(v/v)的甲醇后,分離所用時間明顯縮短且各分析物峰形得到改善,但繼續(xù)增加甲醇含量,分離度反而下降,最終導致分析物無法實現(xiàn)分離。因此,選擇10%(v/v)作為有機添加劑甲醇的最佳含量。

表 1 4種硝基苯酚分析物的柱效、線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、檢出限、定量限

2.3.2緩沖溶液pH

緩沖溶液pH的變化會影響分析物的電離狀態(tài)而使分析物的電泳遷移行為發(fā)生改變。實驗考察了pH在8.80～9.40的范圍內(nèi)對4種硝基苯酚分析物分離的影響。結(jié)果表明,當pH從8.80增大到9.00時,各分析物達到基線分離。繼續(xù)增大pH至9.20,各分析物不僅可實現(xiàn)基線分離且峰形得到改善,但當pH增至9.40時,遷移時間卻大幅延長。綜合考慮分離度、峰形和遷移時間的影響,選擇pH 9.20作為緩沖液最佳pH。

2.3.3緩沖溶液濃度

實驗在10～20 mmol/L范圍內(nèi)考察了硼砂濃度對分離效率的影響。結(jié)果表明,隨著硼砂濃度的增大,分離度無明顯變化,但遷移時間明顯縮短。實驗結(jié)果同時表明在15 mmol/L時各分析物的峰形更好,故選擇15 mmol/L作為硼砂緩沖溶液的最佳濃度。

2.4 方法評價

在最佳分離條件下,4種硝基苯酚分析物的電泳分離譜圖見圖4。

圖 4 ACOF-1涂層毛細管分離4種硝基苯酚分析物的標準電泳譜圖Fig. 4 Typical electropherogram of four nitrophenol analytes with the ACOF-1 coated capillary Buffer solution: 15 mmol/L borate with 10% (v/v) CH3OH, pH 9.20. Applied voltage: -23 kV. Detection wavelength: 214 nm. Capillary: 50.2 cm total length (40.0 cm effective length). Peak identification: 1. 2-nitrophenol (2-NP); 2. 4-nitrophenol (4-NP); 3. 2,4-dinitrophenol (DNP); 4. 2,4,6-trinitrophenol (TNP).

由圖4可看出,以ACOF-1涂層毛細管為分離通道可在20 min內(nèi)實現(xiàn)4種硝基苯酚分析物的基線分離,具有較高的分離效率;由表1可看出柱效較高,說明ACOF-1涂層毛細管對4種硝基苯酚分析物具有良好的分離性能。在最佳條件下,對不同濃度的硝基苯酚分析物進行了分離測定。4種硝基苯酚分析物的線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限見表1。由表1可知,該方法的性能優(yōu)異。

實驗通過各分析物遷移時間和峰面積的日內(nèi)、日間及柱間相對標準偏差(RSDs)對該方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進行評價,結(jié)果見表2。由表2可知,4種硝基苯酚分析物的遷移時間的日內(nèi)、日間和柱間RSDs分別1.4%～1.5%、5.7%～6.8%和3.6%～5.5%;峰面積日內(nèi)、日間和柱間RSDs分別為0.6%～1.6%、2.5%～7.0%和3.5%～9.4%。上述結(jié)果表明該方法分離硝基苯酚分析物具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表 2 4種硝基苯酚分析物的遷移時間和峰面積的日內(nèi)、日間及柱間相對標準偏差

2.5 分離機理

由ACOF-1的結(jié)構(gòu)可知,ACOF-1涂層與分析物之間可能存在疏水相互作用和尺寸選擇作用。分析物的相對疏水性可用其辛醇-水分配系數(shù)(Kow)衡量。由表3可知,4種硝基苯酚分析物的疏水性大小依次為4-NP<2-NP

表 3 4種硝基苯酚分析物的化學結(jié)構(gòu)、log Kow、分子尺寸和分子體積

4種硝基苯酚分析物的分子尺寸和分子體積見表3。各分析物的分子尺寸均小于ACOF-1的孔徑(0.94 nm),表明它們均可進入到ACOF-1孔道內(nèi)。但各分析物分子體積的大小會影響它們通過ACOF-1孔道的難易程度,分子體積越小的越容易通過。實驗結(jié)果顯示各分析物的遷移順序與它們分子體積由小到大的順序一致,表明ACOF-1涂層毛細管對4種硝基苯酚分析物的分離主要基于ACOF-1孔結(jié)構(gòu)的尺寸選擇作用。

3 結(jié)論

本文通過共價鍵合方式制備了ACOF-1涂層毛細管,建立了以其為分離通道分離硝基苯酚類內(nèi)分泌干擾物的OT-CEC新方法。在最佳條件下,該方法可在20 min內(nèi)實現(xiàn)2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、2,4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚4種硝基苯酚模型分析物的基線分離并具有較高的柱效和良好的穩(wěn)定性。ACOF-1孔結(jié)構(gòu)對分析物的尺寸選擇是影響分離行為的主要作用。本工作表明COFs可作為固定相材料用于OT-CEC分離檢測EEDs.