熊 豐，李春喜，席杏媛，周國英,

(1.中國科學院 西北高原生物研究所/中國科學院 藏藥研究重點實驗室，西寧 810008；2.中國科學院 西北高原生物研究所/中國科學院 高原生物適應與進化重點實驗室，西寧 810001；3.青海省青藏高原特色生物資源重點實驗室，西寧 810008；4.中國科學院大學，北京 100049)

大黃是應用廣泛的重要中藥材之一，也是中醫(yī)常用藥物，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《傷寒雜病論》及《本草綱目》中已有記載。大黃為多年生草本，藥用部分為干燥根和根莖[1]。有解毒，清熱瀉火，通經(jīng)逐瘀，涼血止血等多種功效，是“將軍”之藥，一直以來具有巨大的市場需求。唐古特大黃(Rh.tanguticumMaxim.ex Balf)，隸屬于石竹目(Caryophyllales)，蓼科(Polygonaceae)，大黃屬(RheumL.)，主要分布于青海、西藏、四川、甘肅海拔1600～4400m的高海拔地區(qū)[2-5]，是大黃的主要生藥來源之一。而唐古特大黃及相關(guān)藥物生產(chǎn)一直依賴野生資源，大量采挖致使野生大黃日益減少，天然資源近于枯竭[6-8]。因此對唐古特大黃資源的保護顯得尤為重要[9-10]。青海省唐古特大黃以其療效著稱，受到歷來醫(yī)家的青睞，稱“西寧大黃”，為青海省重要的道地藥材。其良好的藥效品質(zhì)與青海省較高的海拔和特殊的氣候條件形成的優(yōu)良種質(zhì)可能有一定的關(guān)系[11-12]。

長期以來，對唐古特大黃的化學成分和藥理作用研究較多[13-18]。盡管大黃的人工栽培歷史可以追溯到20世紀60年代[19]，近年來，青海省人工栽培唐古特大黃的田間管理也有了較為深入的研究[5, 20-21]。但優(yōu)質(zhì)唐古特大黃的適宜種植海拔及品系(品種)選育的工作還需要更多關(guān)注，如甘肅省栽培掌葉大黃由于缺乏良種選育而存在種質(zhì)退化[22]。為了探討唐古特大黃在青海地區(qū)的適宜的移栽種植海拔區(qū)，同時選育出優(yōu)良的唐古特大黃品系(品種)，于2017年7月大黃盛花期野外考察并確定綜合性狀表現(xiàn)較好的單株，2017年10月-2018年5月溫室育苗，2018年6月移栽到海拔2016～3763m不同生態(tài)區(qū)，考察唐古特大黃當年的生長性狀表現(xiàn)，為選育品種和推廣種植提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在青海省樂都縣、民和縣、大通縣、互助縣和果洛州瑪沁縣5地開展，分別編號為A1、A2、A3、A4和A5，樣地海拔分別為2 016 m、 2 180 m、2 409 m、2 971 m和3 763 m，其中 A1～A3為灌淤型沙土，A4～A5為高寒草甸土，隨海拔升高，五處試驗地的年均氣溫呈顯著的下降趨勢。移栽前土壤背景列于表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料 2017年7月大黃盛花期，分別在果洛州瑪沁縣大武鎮(zhèn)野生樣地和互助縣東溝鄉(xiāng)納卡村人工種植4 a田中各選50株編號掛標簽，測株高、莖中部粗、最大葉片長、寬、最大葉片葉裂數(shù)、葉裂深、基生脈數(shù)、葉柄長、基部葉片數(shù)、莖生葉片數(shù)、花色、花序分枝數(shù)，7月底單株收集種子，晾干，測單株種子質(zhì)量、種子數(shù)、千粒質(zhì)量； 9-10月人工挖出地下根莖洗凈，測根莖長、主根莖粗、根莖數(shù)、根莖總鮮質(zhì)量；并進行綜合評價，各選出10株(共20株)，用種子進行株系溫室育苗。

1.2.2 育 苗 2017-10-10在海東生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗智能溫室進行株系育苗，用無紡布育苗袋，袋高30 cm，直徑10 cm，用森林土裝袋27 cm，放入種子3粒，苗高10 cm，4～5葉間苗，保留1株，育苗數(shù)滿足田間移栽試驗需求。2018年4月底測苗高、葉片數(shù)、根莖長、根中部粗、根分枝數(shù)，進行綜合評價，各選出5株系(共10株系),移栽田間試驗。野外采集時10株系性狀表現(xiàn)見表2，其中果洛株系為L1～L5，互助株系為L6～L10。

1.2.3 試驗布置 在5個不同海拔試驗地，從2018年5月8日-6月6日依次移栽，試驗小區(qū)面積5 m×4 m=20 m2，每平方米移栽4株，每小區(qū)80株，每公頃4.00萬株，隨機排列，重復3次。移栽前整地，挖穴，穴深30 cm，直徑25～30 cm，將無紡布袋底部剪去，整袋放入挖好的穴中，埋土1/3，底肥按照磷酸二銨225 kg/hm2和尿素225 kg/hm2混合，每穴施入11.25 g，再埋土與地 面平。

1.3 指標觀測

2018年9月取樣測數(shù)據(jù)。小區(qū)兩邊第2行為樣段區(qū)，數(shù)據(jù)均在樣段區(qū)內(nèi)取得。

1.3.1 植株田間評價 各試驗點移栽15 d后，整個小區(qū)內(nèi)觀測成活數(shù)，計算移栽成活率，并進行補栽，2018年8月統(tǒng)計補栽后成活率，觀測植株株型及田間整齊度。

1.3.2 植株地上性狀 9月采樣觀測，在樣段內(nèi)連續(xù)測10株，統(tǒng)計葉片數(shù)，用鋼卷尺測株高、最大葉片的葉長、葉寬、葉柄長、葉裂長和葉裂寬，計算葉裂占比。

1.3.3 植株地下性狀 測完地上數(shù)據(jù)后，挖出對應地下根，沖洗干凈，用鋼卷尺測根長，用游標卡尺測最大根直徑，現(xiàn)場在DT-502電子天平上稱根莖鮮質(zhì)量，記錄側(cè)根數(shù)。

1.3.4 鮮質(zhì)量產(chǎn)量 用根莖鮮質(zhì)量×每公頃有效株數(shù)為每公頃根莖鮮質(zhì)量產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS V20.0統(tǒng)計軟件對測定數(shù)據(jù)進行差異顯著性和多重比較，利用R軟件(R version 3.5.1)結(jié)合“Nisus-Liu/GRA”包進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，采用OriginPro 2018進行作圖?；疑P(guān)聯(lián)度分析采用不同株系的平均株高、葉片數(shù)、最大葉的葉長、葉寬、葉柄長、葉裂長、葉裂寬、葉裂占比以及側(cè)根數(shù)、根長、根直徑、根鮮質(zhì)量和產(chǎn)量，共計13個性狀參數(shù)組成數(shù)據(jù)集合，以各性狀的最優(yōu)值為參考序列，以各株系平均值為對比序列，計算各株系與參考序列的灰色關(guān)聯(lián)度，并進行排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔株系間田間評價

不同海拔樣點，移栽成活率和補栽成活率均顯著不同(P<0.01)，A4樣點移栽和補栽成活率均為最高，分別為87.32%和97.33%，其次為A5樣點，分別為85.89%和93.79%。A1樣點移栽成活率高于A2、A3樣點，達83.50%，但由于補栽后發(fā)生根腐病，其補栽成活率低于A2與A3樣點，僅為80.83%。

各試驗點不同株系間移栽后成活率差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)(表3)，株系間移栽成活率從高到低依次為L8>L9>L7>L6>L10>L1>L2>L3>L5>L4，移栽后株系與試驗點間互作成活率F=2.52>F0.01=1.79，差異極顯著(P<0.01)；補栽成活率株系間差異不顯著，僅A1樣點因部分株系出現(xiàn)根腐病導致株系間差異顯著(P<0.01)，補栽后株系與試驗點間互作成活率F=1.14

不同株系間株型和田間整齊度也有顯著差異(表3)，A1、A2和A3樣點的株型L1、L2、L3、L5、L6、L7號株系表現(xiàn)為直立，L4、L8、L9、L10號表現(xiàn)為半直立，A4和A5樣點所有株系均表現(xiàn)為半直立。田間整齊度除L4外，其他均表現(xiàn)為整齊或較整齊。

2.2 不同海拔間植株性狀差異

植株各項性狀表現(xiàn)均隨海拔增大而呈現(xiàn)顯著降低趨勢(P<0.01)。唐古特大黃所有性狀在A1樣點(樂都)均表現(xiàn)最佳(圖1)，平均株高 61.30 cm，葉片數(shù)9.46葉，側(cè)根數(shù)4.67條(圖1-A)，最大葉的葉長、葉寬、葉柄長、葉裂長、葉裂寬及葉裂占比分別為58.92 cm，51.44 cm，37.05 cm，18.29 cm，7.79 cm和92.30%(圖1-B和1-C)，平均根長、根直徑、根鮮質(zhì)量分別為32.01 cm，4.81 cm和444.10 g(圖1-D)，根據(jù)單位面積有效植株數(shù)計算出A1樣點鮮質(zhì)量產(chǎn)量為 14 473.78 kg/hm2。與之相反，A5樣點(果洛)表現(xiàn)最差，平均株高僅11.84 cm，葉片數(shù)平均為 4.06片，側(cè)根數(shù)2.37條，其最大葉的葉長、葉寬、葉柄長、根長、根直徑分別為15.85 cm、13.82 cm、 6.21 cm、14.92 cm和1.51 cm，且A5樣點葉片沒有發(fā)生葉裂，同時，相比A1樣點，A5樣點的根鮮質(zhì)量和產(chǎn)量分別降低了425.34 g和 13 766.81 kg/hm2。A4樣點(互助)僅側(cè)根數(shù)與A5沒有顯著差異，其他性狀均顯著(P<0.01)優(yōu)于A5樣點。同時，A4樣點除根長與A3樣點沒有顯著差異外，其他性狀均顯著(P<0.01)低于A3樣點。

而A2樣點(民和)可能由于移栽前1個月使用了“玉米思”除草劑(玉米田專用)，對大黃地上部分的生長造成影響，株高、葉長、葉寬、葉柄長以及葉裂長、葉裂寬的表現(xiàn)反而低于A3樣點(大通),A2與A3點的株高、葉長、葉寬、葉柄長葉裂長和葉裂寬分別為39.75 cm與57.68 cm，36.00 cm與45.71 cm，31.21 cm與37.63 cm，27.40 cm與31.71 cm，11.07 cm與14.00 cm和4.47 cm與7.11 cm；A2樣點葉片數(shù)(7.03)略低與A3樣點(7.48)，但差異不顯著，同樣，植株的側(cè)根數(shù)(3.80與3.81)和葉裂占比(73.00%與68.01%)在A2與A3樣點間差異不顯著；而地下性狀如根長、根直徑、根鮮重和產(chǎn)量均服從隨海拔升高而降低的趨勢，在A2和A3樣點間差異顯著，其值分別為30.19 cm與25.22 cm，3.96 cm與3.42 cm，270.69 g與176.22 g和10 013.56 kg/hm2與6 509.60 kg/hm2。

2.3 株系間植株性狀的灰色關(guān)聯(lián)分析

將10個株系的13個性狀指標組成一個灰色系統(tǒng)，10個株系分別為L1～L10，13個性狀指標分別為C1～C13，同時以所有株系中各性狀的最優(yōu)值構(gòu)成一個理想株系L0，L0和L1～L10的各項指標均列于表4中?；诨疑到y(tǒng)中數(shù)據(jù)應為無量綱化數(shù)據(jù)，采用min-max歸一化方法(正向指標)對表4數(shù)據(jù)進行無量綱化處理，即x′= (x-min)/(max-min),歸一化后，L0各項指標均為1。利用R包“GRA”中的函數(shù)GRA，求出各比較株系與參考株系的灰色關(guān)聯(lián)程度及其排序(表5)，關(guān)聯(lián)程度越高的株系即越接近理想株系，為本次試驗的較優(yōu)株系。本試驗中株系排序依次為L2、L9、L1、L10、L5、L3、L6、L8、L4、L7。采用最短距離法對10個株系進行系統(tǒng)層次聚類，得到結(jié)果如圖2所示。根據(jù)聚類結(jié)果，L2、L9、L1、L10和L5可以聚為一類，說明這5個株系表現(xiàn)較優(yōu)，具有進一步研究的潛力，L3、L6、L8其次，可以作為備擇選項。

圖中相同圖案柱狀圖或點線圖上標注的不同字母表示同一性狀在不同海拔之間有顯著差異(P<0.05)。

表4 各株系13個性狀平均表現(xiàn)及參考株系性狀均值Table 4 Average values of 13 traits in 10 lines and values of 13 traits in reference line

表5 各株系灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)及排序結(jié)果Table 5 Grey relational coefficient and ranking of 10 lines

3 結(jié)論與討論

青海省的自然條件和農(nóng)業(yè)自然資源具有過渡性特點并表現(xiàn)出明顯的垂直地域差異等多種類型的生態(tài)區(qū)域，地形地貌和氣候等自然條件的垂直變化十分明顯。本研究結(jié)果表明海拔高度對唐古特大黃育苗移栽后成活率、生長性狀、產(chǎn)量等指標影響極大。海拔對于唐古特大黃移栽苗的生長和成活率表現(xiàn)出二元化的影響。

圖2 灰色關(guān)聯(lián)分析株系間聚類結(jié)果Fig.2 Cluster results of grey relational analysis in 10 lines

一方面，低海拔移栽樣地帶給唐古特大黃移栽苗的生長益處是顯而易見的。海拔低，氣溫高，生長速度快，生長量大，反之生長速度慢，生長量小[23]。海拔2 016 m～2 409 m地區(qū)年均氣溫 4.7～7.8 ℃，生長量高，如唐古特大黃藥用部分根莖性狀，單株根鮮質(zhì)量176.22～444.10 g，根鮮質(zhì)量產(chǎn)量6 509.60～ 14 473.78 kg/hm2，海拔 2 971～3 763 m以上地區(qū)年均氣溫2.0～0.6 ℃，生長量低，單株根鮮質(zhì)量僅18.76～91.04 g，根鮮質(zhì)量產(chǎn)量僅706.97 ～3 556.60 kg/hm2，最低海拔根鮮重和產(chǎn)量相比最高海拔分別增加了22.67倍和19.47倍。同時，在A4、A5兩個樣點，所有株系株型均表現(xiàn)為半直立狀態(tài)，而低海拔的A1、A2、A3樣點，則多數(shù)株系表現(xiàn)為直立株型，這也與低海拔樣點較高氣溫帶來的快速生長相關(guān)。

另一方面，海拔對移栽苗的成活率呈現(xiàn)出不同的影響模式。該試驗中移栽種苗在A4和A5樣點成活率最高，即在其種源地具有較好的成活率，這說明其對于種源生境的適應較好。這與針對竹子的相關(guān)研究結(jié)果類似[24]，而其余3處海拔較低樣點移栽成活率在海拔最低的A1樣點成活率最高，可能與低海拔地區(qū)較為溫暖的氣候條件相關(guān)，但同時此氣候條件可能也會導致病害發(fā)生概率的增加，如A1樣點在補栽后發(fā)生根腐病。對于種源生境為較高海拔地區(qū)的唐古特大黃而言，由于長期適應環(huán)境，其具有較優(yōu)秀的抗寒抗凍能力，但高海拔地區(qū)病害發(fā)生率較低，可能導致唐古特大黃缺乏相應的抗病機制。因而在后期新品種的大規(guī)模推廣中，應注意病蟲害的防治及避免暖濕生境。

有研究表明，高海拔大黃中幾種有效成分的含量都顯著高于低海拔大黃[25]，意味著高海拔栽培大黃可能具有更優(yōu)品質(zhì)。但同時，也有研究表明栽培唐古特大黃的品質(zhì)與種植年限顯著相關(guān)[5, 26]。因此，考慮到產(chǎn)量、質(zhì)量及總收益，適宜的唐古特大黃栽培海拔范圍還需要對多年數(shù)據(jù)進行進一步的分析。

灰色關(guān)聯(lián)分析是用于分析多因素系統(tǒng)的重要方法，因而在選種育種的工作中被廣泛應用[27]。本研究中，綜合分析了唐古特大黃的13個性狀，需要同時評價10個株系表現(xiàn)，因此選用灰色關(guān)聯(lián)分析可以很好的反映不同株系間的綜合差異。通過設置理想的參考株系L0，計算其他株系與參考株系的關(guān)聯(lián)程度，可以得到與參考株系最為相近的株系，即表現(xiàn)最優(yōu)的株系。從本年度植株性狀表現(xiàn)的結(jié)果綜合分析，L1、L2、L5、L9和L10號株系表現(xiàn)優(yōu)良，其中L1、L2、L5均為果洛株系，說明原產(chǎn)地為果洛的株系可能具有更優(yōu)的遺傳背景。

本研究為選育真正的唐古特大黃優(yōu)良品種積累了經(jīng)驗和數(shù)據(jù)，運用灰色關(guān)聯(lián)分析方法，為唐古特大黃新品種的選育提供了可靠思路，同時，研究樣地涉及海拔2 016～3 763 m，共5個梯度，這也為未來新品種的推廣范圍提供了理論依據(jù)。本試驗為移栽后第1年結(jié)果，更長時間的試驗觀測仍需要進一步開展。