任瑞華，李俊楠，楊 君，寧鵬飛，張振文,3

(1.西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2.山西堯京酒業(yè)有限公司，山西臨汾 041500；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌 712100)

酚類化合物是指分子結構中有一個至多個羥基連接在苯環(huán)上的植物成分總稱，其因能夠影響葡萄酒的收斂性、苦味、澄清度和穩(wěn)定性[1-2]，以及其抗氧化、抗菌、抗病毒[3]和抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化變性[4]等生理作用，得到研究者的重視。依其化學結構，可分為非類黃酮類和黃酮類物質。前者主要是酚酸，包括羥基苯甲酸和羥基肉桂酸及其衍生物等，含量僅占酚類物質的 1%～5%[5-6]。后者包括花色苷類、黃酮醇類、黃烷醇類等。白葡萄中，由于VvmybA1在馴化過程中發(fā)生等位基因變異，從而導致花色苷類物質缺失[7]。黃烷醇類則在葡萄及葡萄酒的苦味和收斂性上發(fā)揮著重要作用。研究表明，白葡萄中黃烷三醇的含量較低，因而更適合釀造果香豐富的酒[8-9]。自然界中酚類物質通常以糖苷結合態(tài)的形式存在，如楊梅酮-葡萄糖苷和槲皮素-葡萄糖苷等[10]。研究報道，糖苷結合態(tài)的酚類物質在葡萄浸漬過程中水解釋放出游離的糖苷配基，能夠增加‘雷司令’和‘霞多麗’葡萄酒花果香味，但未改變其苦味和收斂性[11]。

葡萄酒中的酚類物質主要來源于浸漬和發(fā)酵的葡萄。目前研究上多通過各種栽培措施來提高果實酚類物質含量，以提高葡萄酒的品質。如控制葉幕層厚度和摘除副梢[12]、降低葡萄樹體負載量[13]及轉色期進行適當果粒疏除[14]等，能夠顯著提高成熟果實酚類物質含量。此外，對果實進行外源糖處理及體外糖飼養(yǎng)葡萄細胞懸浮液也顯示上調花色苷相關基因的表達[15-16]。Lecourieux等[17]對蔗糖處理的‘赤霞珠’葡萄進行轉錄組分析發(fā)現，蔗糖處理改變了果實內的信號轉導和次生代謝等生物過程，主要影響bzip和bHLH轉錄因子家族成員對其靶基因的調控。然而，有關果實本身的基本理化特性與酚類物質積累的探討較少，在白色釀酒葡萄上更鮮有報道。本研究以山西省襄汾地區(qū)2種白色釀酒葡萄‘雷司令’和‘小芒森’為試材，探討不同品種理化特性對果實酚類物質積累的影響，以期為釀酒葡萄品種的選擇、提高果實中酚類物質含量和白葡萄酒陳釀潛力提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2018-2019年在山西省襄汾縣堯京酒莊進行。

1.1 試驗材料

供試品種為‘雷司令’(Riesling，RI)和‘小芒森’(Petit Manseng，PM)，2012年定植于山西省襄汾縣堯京酒莊(位于山西省中南部，北緯 35～36°，海拔500～600 m，基本處于平原地區(qū)。屬于半干旱、半濕潤季風氣候區(qū)，暖熱多雨，雨熱同季，年均氣溫11.5 ℃，1月平均氣溫-4.5 ℃，年降雨量550 mm左右，無霜期185 d)。葡萄園南北行向，葡萄樹齡7 a，株行距1 m×3 m，單籬架為“廠”字型樹形，垂直籬壁式葉幕，單芽修剪，每棵樹留8 個梢，常規(guī)化管理。

1.2 試驗方法

果實采樣：花后30 d 9：00-12：00進行第1次采樣，花后60 d(轉色期)第2次，以后每隔10 d采樣1次，直至果實成熟。從果穗的東、西、南、北4個方向及上、中、下部位各采大小一致、無病蟲害的樣果共600粒，迅速用液氮冷凍，并立即帶回實驗室，放于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.1 果實還原糖、可滴定酸、可溶性固形物(TSS)、pH和物理指標測定 從每個樣品中隨機選取50粒漿果，用數顯游標卡尺測定漿果橫、縱徑。剝皮后果肉擠汁用于測定還原糖、可滴定酸、可溶性固形物(TSS)、pH，方法參照《葡萄酒分析檢驗》[18]。還原糖采用斐林試劑熱滴定法，結果以葡萄糖(g/L)計；總酸采用NaOH滴定法，結果以酒石酸計(g/L)；可溶性固形物用手持糖量計；pH使用pH計，均重復3次。

從每個樣品中隨機選取100粒漿果，稱量鮮質量，隨后剝皮稱量獲得百粒漿果果皮鮮質量。將稱量后的果實和果肉分別放于干凈的培養(yǎng)皿中于72 ℃烘箱中烘至恒質量，稱量后計算各自的干質量，重復3次。

1.2.2 漿果果皮總酚和總單寧的提取和測定 提取方法：隨機選取-80 ℃冰箱中的凍樣10 粒，立即剝皮，將果皮用液氮速凍后打成粉末，在凍干機中凍干。稱取1.000 g干粉溶解于10 mL鹽酸甲醇溶液(φ=60%甲醇，φ=0.1%鹽酸)中， 30 ℃下超聲提取30 min，隨后4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，收集上清液。將沉淀物重復上述提取步驟2次，收集并混合3次提取液放置 -80 ℃儲存，重復3次?？偡訙y定采用福林-肖卡法[19]，總單寧測定采用甲基纖維素沉淀法(MCP法)[20]。

1.2.3 漿果果皮單體酚的提取和測定 單體酚提?。悍Q取‘1.2.2’中的葡萄皮干粉凍樣1.000 g，溶于1 mL蒸餾水和9 mL乙酸乙酯的混合液中，25 ℃、130 r/min搖床上震蕩30 min(避光)， 8 000 r/min下離心5 min，取上清液于50 mL離心管中，重復上述步驟對沉淀物重復提取4 次，合并混勻所有上清液，33 ℃旋轉蒸發(fā)至干，最后用色譜甲醇定容至1 mL，-80 ℃下保存，備用，重復3次。單體酚測定采用HPLC-MS/MS法[21]。

1.3 數據處理與統計分析

采用Excel 2010對所有數據進行統計分析，采用SPSS 20.0對數據進行方差分析和獨立樣本t檢驗，并用SPSS 20.0對果實理化指標與總酚、總單寧和單體酚含量進行相關性分析。用Excel 2003繪圖。

2 結果與分析

2.1 開花、轉色和采收時間

由表1可知，2個品種的開花時間接近，均在5月中旬，而‘小芒森’(PM)的轉色和采收時間分別較‘雷司令’(RI)晚1周和1個月左右。相比于2018年和2019年2個品種的轉色時期較晚(轉色時間以50 %的漿果變軟為標準)。

表1 2018和2019年開花、轉色和果實采收日期Table 1 Flowering,veraison (50% of soft berries) and harvest date in 2018 and 2019

2.2 不同品種漿果生長過程中還原糖和總酸的變化

圖1和圖2結果顯示，2018和2019年2個品種果實還原糖和可溶性固形物含量均隨果實成熟而逐漸升高?！姿玖睢麑? a采收時還原糖均為170 g/L，而‘小芒森’分別高達268和273 g/L，分別是‘雷司令’的1.58倍和1.61倍。由圖1和圖2還可看出，2018年中花后30～70 d時，2個品種還原糖含量相當，但此后至果實采收時，‘小芒森’均遠高于‘雷司令’；而2019 年從花后60 d開始出現差異，到花后90 d時達到最大。 2 a的可溶性固形物含量與還原糖趨勢一致，但2019 年較2018有所提高(圖1和圖2)?？傻味ㄋ岷吭? a間均呈降低的趨勢，而2019年含量較2018有所降低。在采收時‘小芒森’可滴定酸含量分別為5.7和5.35 g/L，‘雷司令’分別為 5.45和5.12 g/L。pH的變化與可滴定酸相反(圖1和圖2)。

圖1 2018年不同品種果實生長過程中還原糖和可滴定酸含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic change of reducing sugar and titratable acid content of different berries during grape development in 2018

2.3 不同品種漿果生長過程中果粒大小、漿果和果皮質量的變化

由表2可以看出，2018年‘雷司令’漿果大小(橫徑×縱徑)和橫徑隨果實生長逐漸變大，雖然縱徑在花后90～100 d時有所減小，但均在采收時達到最大值；‘小芒森’漿果大小和橫縱徑在花后70～90 d時不斷增大，而此后開始減小。整個生長過程中‘小芒森’果粒顯著小于‘雷司令’，但兩者的橫徑/縱徑差異較小。2 a中果實大小變化趨勢基本一致，但2019年較2018 年果粒有所縮小(表3)。

如圖3所示，2018 年‘小芒森’百粒漿果鮮質量和干質量在花后30～90 d期間逐漸增加，而此后有所降低，這與其漿果大小的結果一致；‘雷司令’在整個生長過程中均呈遞增趨勢，其鮮質量和干質量在采收時分別達到最大值(205.49和 162.83 g)，是同時期‘小芒森’的1.76倍和2.02倍。然而，‘雷司令’百粒漿果果皮鮮質量在花后70～80 d時增加，而此后逐漸降低，果皮干質量則在花后70～100 d時逐漸降低，采收時略有升高；‘小芒森’的果皮鮮質量和干質量在花后30～110 d時表現出一致的遞增趨勢，而此后略有降低，其在花后90～110 d時顯著高于‘雷司令’(圖3)。最終，‘雷司令’果皮鮮質量和干質量百分比在果實生長過程中呈總體遞減趨勢，而‘小芒森’呈遞增趨勢，平均分別高出‘雷司令’0.89倍和 1.10倍(圖3)。2019 年果實和果皮鮮質量及干質量變化趨勢與2018年基本一致，但2個品種的果皮鮮質量和干質量百分比均呈遞增的趨勢，其百分含量也較2018 年有所升高。品種間‘小芒森’仍大于‘雷司令’(圖4)。

圖2 2019年不同品種果實生長過程中還原糖和總酸含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of reducing sugar and titratable acid content of different berries during grape development in 2019

表2 2018年果實成熟期間漿果大小的動態(tài)變化Table 2 Dynamic change of berry size during ripening period in 2018

表3 2019年果實成熟期間漿果大小的動態(tài)變化Table 3 Dynamic change of berry size during ripening periodin 2019

圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

圖4 2019年不同品種果實成熟期間漿果和果皮質量以及果皮占比的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of berry and skin mass and ratio of skin to berry during ripening period in 2019

2.4 不同品種漿果成熟期間總酚和總單寧含量的變化

由圖5可以看出，2018和2019 年2個品種果皮總酚含量均隨果實成熟而降低?！姿玖睢た偡釉诨ê?0～110 d時保持穩(wěn)定，而‘小芒森’則在花后100～140 d時變化較小。2018 年采收時‘雷司令’和‘小芒森’總酚含量分別為 12.11和19.47 mg/g，2019年有所降低，分別為 11.03和17.06 mg/g。除2018 年花后30 d時外，‘小芒森’均顯著高于‘雷司令’，這與還原糖含量和果皮質量的結果一致。

由圖6可以看出，2018和2019 年2個品種果皮總單寧含量均隨果實成熟而降低。‘雷司令’果皮中的總單寧含量在花后90～110 d時保持穩(wěn)定，而‘小芒森’在花后110～140 d時變化較小，這與總酚結果基本一致。2018 年采收時‘雷司令’和‘小芒森’的總單寧含量分別為4.14和 12.97 mg/g，類似地，2019 年分別為4.39和 12.68 mg/g。此外，除花后30 d外，‘小芒森’均顯著高于‘雷司令’，這與總酚含量的結果一致。

圖5 2018和2019年不同品種果實成熟期間果皮總酚含量的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic change of total phenol content in different cultivars skins during ripening period in 2018 and 2019

圖6 2018和2019年不同品種果實成熟期間果皮總單寧含量的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic change of total tannin content in different cultivars skins during ripening in 2018 and 2019

2.5 不同品種成熟漿果單體酚組分及含量的變化

本研究對2018年2個品種成熟果實的單體酚類物質進行檢測，結果顯示‘雷司令’中共檢測到21種，而‘小芒森’為24種(表4)。其中，有14種在兩者中同時出現，7種僅出現在‘雷司令’中，而10種僅出現在‘小芒森’中。這些物質可分為酚酸類、黃烷醇類和黃酮醇三大類，但每類單體物質組分和含量在品種間不同?！姿玖睢泄矙z測到4種酚酸類物質，其中阿魏酸占比可達 67.68%；‘小芒森’中共檢測到9種，沒食子酸是其主要成分(58.40%)。‘雷司令’和‘小芒森’中分別檢測到4和5種黃烷醇類物質，表兒茶素是主要成分，2個品種分別占黃烷醇總量的78.22%和43.29%。黃酮醇類在3類物質中種類最豐富，在‘雷司令’和‘小芒森’中分別檢測到13和10種。楊梅酮、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐在‘雷司令’中含量較高，占黃酮醇總量的75.04%。然而，‘小芒森’中槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-半乳糖苷含量較高。此外，從表4也可以看出2個品種中均出現許多糖基化單體，‘雷司令’和‘小芒森’中分別檢測到10和7 種，其糖基化配體主要是葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。

由表4可知，黃酮醇類是2個品種的主要單體酚，分別占總量的98.43%和98.00%(圖7)?！∶⑸悬S酮醇類和酚酸類物質總量均顯著高于‘雷司令’，甚至酚酸類物質比‘雷司令’高2.79倍，然而后者的黃烷醇類物質總量顯著高于‘小芒森’(圖7)。最終，‘小芒森’成熟漿果果皮的單體酚總量比‘雷司令’高6.20%。此外，兩者的糖基化類單體酚含量也有所不同?！姿玖睢刑腔宇惖谋壤秊?3.77%，而‘小芒森’高達 97.81%，這與成熟果實還原糖含量的結果一致。

表4 2018年不同品種成熟果實單體酚組分及含量Table 4 Monomer phenol components and contents in ripe fruits of different varieties in 2018

圖7 2018年不同品種成熟漿果果皮單體酚組分及比例Fig.7 Composition and percentage of monomer phenol in ripe berries-skins of different cultrivars in 2018

2.6 果實基本特性與酚類物質的相關性分析

為了探討果實理化特征與酚類物質積累的關系，本研究對2個品種果實的基本指標與果皮中總酚、總單寧和單體酚含量進行相關性分析，結果顯示果皮的總酚、總單寧和單體酚含量均與漿果鮮質量和干質量負相關，且漿果干質量與總單寧含量在0.05水平上有顯著性差異(表5)。然而，其他指標與酚類物質含量正相關。果皮干質量百分比與總酚和總單寧的相關系數最高，還原糖、總酸、漿果鮮質量和干質量百分比與單體酚含量相關性較高。

表5 果實特征與酚類物質的相關性分析Table 5 Correlation analysis between fruit characteristics and phenol content

3 討論與結論

盡管葡萄果實的酚類物質組成和含量受生長條件、氣候、土壤、品種和果實成熟度等多種因素影響[22]，但品種的基因型對其影響超越任何環(huán)境因素[8]。Somkuwar等[23]對9個白色釀酒葡萄果實酚類物質研究顯示，不同品種的酚類物質含量差異較大，其中‘大滿勝’含量最高，‘長相思’次之，‘雷司令’中等，而‘鴿籠白’和‘白詩南’含量最低。楊濤等[24]對新疆地區(qū)幾個白色釀酒葡萄的酚類物質分析表明，’小芒森’果實酚類物質含量較高。類似的，本研究中也發(fā)現‘小芒森’的總酚、總單寧和單體酚含量在整個成熟過程中均顯著高于‘雷司令’。品種能夠決定葡萄的果粒大小、質量、果皮比例和果實糖酸含量等特征，而這些也是影響果實品質的重要因素。樂小鳳等[25]對香格里拉和寧夏玉泉營地區(qū)不同粒徑大小的‘霞多麗’酚類物質進行研究，結果表明總酚含量為小果粒>中果粒>大果粒。果粒大小能夠影響漿果的比表面積(漿果表面積∶漿果體積)，相較于大果粒而言，小粒果實具有更大的果皮比表面積，因而能夠積累更多的酚類物質，最終能夠提高葡萄酒中酚類物質[26-28]。這與本研究中‘小芒森’果實較小的果粒，較高的果皮比重，以及成熟果實中較高的酚類物質含量一致。此外，糖作為次生代謝的前體物，也能影響果實酚類物質形成。Hosu等[19]對羅馬尼亞地區(qū)3個白色釀酒葡萄的酚類物質積累研究顯示，果實酚類物質與糖含量具有較高的相關性。Castellarin等[29]和Martínez-Lüscher等[30]報道，在果實生長發(fā)育過程中，花色苷的合成與果實糖含量增長同步，且可溶性固形物(TSS)與果實花色苷含量呈顯著正相關。本試驗相關性分析結果也表明：酚類物質含量與還原糖、果皮質量及其果皮百分比呈正相關。依此，‘小芒森’果實中高的酚類物質含量可能得益于其較小的果粒、較高的果皮比重和還原糖含量。

相異于紅色品種，白葡萄果實單體酚類主要由酚酸、黃烷三醇和黃酮醇三大類組成，可以提供葡萄酒所需要的酒體，其含量也有助于釀酒師決定葡萄是適宜直接食用還是進一步釀酒[31]。本研究結果顯示，酚酸和黃烷三醇在2個品種中占比均較低，這可能與白葡萄酒較弱的苦味和收斂性有關[8-9]。然而，黃酮醇類物質則是2個品種中主要的單體酚，在兩者中占比均高達90%以上，這與楊濤等[24]和Brandt等[32]的研究結果一致。黃酮醇類物質呈黃色，有助于白葡萄酒顏色的展現，因為其能夠抵抗UV和病原菌入侵植物，并為葡萄酒提供抗氧化屬性而受到廣大研究者的關注[33-34]。研究報道，黃酮醇類物質的組成和含量在品種間存在顯著差異，可作為品種間識別的標志[28,33,35]。本研究中‘小芒森’果皮黃酮醇含量略高于‘雷司令’，但后者種類更豐富?！姿玖睢袟蠲吠?、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐占黃酮醇含量較高，而槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-半乳糖苷在‘小芒森’果實中含量較高，這與楊濤等[24]的研究結果一致。然而，Brandt等[32]和Samoticha等[36]的研究表明在‘雷司令’果實中未檢測到楊梅酮，這與本研究結果相異?？赡苁且驗閱误w酚類物質的高效液相色譜檢測受色譜條件、分析標品及檢測方法等多種因素影響。因此，為了明確‘雷司令’果實的標志性物質，還需要進一步優(yōu)化試驗條件和再次檢測。

此外，本研究中2個品種均存在較高比例的糖基化黃酮醇類物質，這可能與糖作為糖基配體參與果實次生代謝產物的糖基化修飾相關[19]。糖基化是賦予和調節(jié)細胞中小分子物質活性的關鍵機制[37]，能夠賦予黃酮醇類物質生物醫(yī)學活性，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷能夠誘導膽固醇的合成因而具有保護細胞的活性、槲皮素葡萄糖苷酸具有抗動脈粥樣硬化的活性、槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸和槲皮素-3-O-半乳糖苷具有抗抑郁的活性[33,38]。通過糖基化也能夠提高黃酮醇類物質的水溶性和穩(wěn)定性，使其易于積累在細胞中[39]。果實中存在許多糖基轉移酶[28,40]，如Fh3GT1利用UDP-葡萄糖提供的糖供體參與矮牽牛中類黃酮物質的糖苷化[41]。這些糖基化物質的出現也增加了次生代謝產物的多樣性，如黃酮醇-3-O-葡萄糖苷酸、黃酮醇-3-O-葡萄糖苷和黃酮醇-3-O-半乳糖苷[39]。本研究中，‘小芒森’果皮中糖基化占比為97.81%，顯著高于‘雷司令’，這可能與糖苷結合態(tài)物在轉色后積累有關[42]，果實中較高的還原糖為糖基化反應提供基礎。

綜上所述，與‘雷司令’相比，’小芒森’果實較小的果粒、較高的果皮占比和還原糖含量有利于酚類物質積累，使其含量最終高于‘雷司令’。這將為產區(qū)進行釀酒葡萄品種的選擇提供依據及未來果實酚類物質積累的研究奠定基礎。