常利華，南禧辰，張曼瑞，趙勁竹，嚴(yán)敏，楊陽

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710000）

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)各種損傷因子的刺激所產(chǎn)生的防御反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等癥狀。目前在改善炎癥的藥物中，合成的化學(xué)抗炎藥均具有明顯的不良反應(yīng)，而天然藥物具有資源豐富、療效確切、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，故成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[1-2]。

膜苞鳶尾（Iris scariosaWilld .exLink）屬于鳶尾科鳶尾屬植物，主要分布于新疆等地區(qū)，其根狀莖和根是新疆中草藥鐮葉馬藺根的藥材基源，具有清熱解毒、利咽等功效，可治療癌癥、炎癥、細(xì)菌和病毒感染等多種疾病[3-4]。膜苞鳶尾中分離得到的天然產(chǎn)物以黃酮為主，而黃酮的抗炎活性是其最主要的生物活性之一[5]。鳶尾屬植物根及根狀莖在世界上許多國家和地區(qū)都被用于治療炎癥相關(guān)疾病，但目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道過其對(duì)活化巨噬細(xì)胞炎性遞質(zhì)生成的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過脂多糖（LPS）刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系建立炎癥細(xì)胞模型[6]，檢測從膜苞鳶尾根狀莖提取分離得到的5種不同極性部位對(duì)炎癥模型細(xì)胞中炎癥介質(zhì)NO分泌量的影響[7-8]，為后續(xù)分離純化具有抗炎活性的天然產(chǎn)物以及進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

膜苞鳶尾的根及根狀莖采自新疆察布查爾錫伯自治縣，經(jīng)北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分類學(xué)教授劉全儒鑒定為鳶尾科鳶尾屬植物膜苞鳶尾（Irisscariosa Willd. exLink）；RAW264.7細(xì)胞，購自中國北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.2 儀器與試藥

Multiskkango1510全波長酶標(biāo)儀，ThermoScientific；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Ti-u型倒置顯微鏡，日本Nikon公司；UV-1780紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。

脂多糖（LPS），Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），99.7%，MkSeal；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），純度≥98.0%，上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；NO檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：JZ15020119），南京景竹生物科技有限公司，HPLC≥98%。

1.3 膜苞鳶尾提取物溶液的制備

1.3.1 膜苞鳶尾不同極性部位提取物的制備

取膜苞鳶尾藥材粉碎，過20目篩，儲(chǔ)于干燥器中備用。將藥材粉末分別加入到石油醚（沸程30～60）、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水中，料液比1∶30（g∶mL），于溫度40 ℃、功率450 W下超聲提取30 min，布氏漏斗抽濾2次，50 ℃左右減壓濃縮至膏狀，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取物溶液配制

稱取膜苞鳶尾根及根狀莖的正丁醇極性部位、水極性部位、二氯甲烷極性部位、乙酸乙酯極性部位和石油醚極性部位，在1 mL EP管中用適量的DMSO溶解并制成200 μg/mL的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，控制DMSO量在千分之一以下。

1.4 膜苞鳶尾提取物抗炎活性試驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組設(shè)計(jì)

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含100 U/mL雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長，隔日傳代。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞180μL，接種于96孔培養(yǎng)板。按照表1進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)給藥組設(shè)置3個(gè)給藥濃度，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，各孔加入10 μg提取物溶液，各孔終體積用DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充至200 μL。試驗(yàn)中，以無細(xì)胞的培養(yǎng)基（處理0）為空白組，加細(xì)胞的培養(yǎng)基（處理1）為正常對(duì)照組。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.2 MTT法檢測提取物對(duì)細(xì)胞活力的影響

將表1中各組細(xì)胞于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，吸走細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)4 h后，棄掉細(xì)胞上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩器上輕搖10 min，結(jié)晶溶解后，立即比色測定。空白組（處理0）調(diào)零后，用全波長酶標(biāo)儀在490 nm波長處測出細(xì)胞對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的吸光度A。根據(jù)公式1計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中，A給藥組為處理2～6的吸光度數(shù)值，A空白為處理0的吸光度數(shù)值；A正常對(duì)照組為處理1的吸光度數(shù)值。

1.4.3 Griess法測定提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響

LPS可以刺激誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生多種與炎癥相關(guān)的遞質(zhì)和細(xì)胞因子，從而建立炎癥細(xì)胞模型。因此，用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞代替表1中2～6組的正常細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，并設(shè)置未給藥的LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥細(xì)胞作為模型對(duì)照組。

在炎癥反應(yīng)中，NO是炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)因子和調(diào)節(jié)因子。NO參與多種炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與多種炎癥因子互相作用。NO在炎癥反應(yīng)每一階段都有產(chǎn)生，NO的過量產(chǎn)生與炎癥密切相關(guān)，而抑制NO生成則是抗炎活性的直接指標(biāo)[9-10]。用NO檢測試劑盒按照說明書要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.007 7X+0.073 8，r=0.998 4。將表1中各組細(xì)胞于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，每孔取50 μL上清液按照NO檢測試劑盒說明書的要求進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到NO濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7細(xì)胞活力測定結(jié)果

采用MTT法檢測膜苞鳶尾不同極性部位對(duì)RAW264.7炎癥細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖1顯示。當(dāng)石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水部位在質(zhì)量濃度為5～20 μg/mL范圍內(nèi)，作用于RAW264.7炎癥細(xì)胞24 h，給藥組細(xì)胞的存活率均大于100%，且在5 μg/mL和15 μg/mL濃度下可刺激RAW264.7細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。正丁醇部位在質(zhì)量濃度為50～200 μg/mL范圍內(nèi)，給藥組細(xì)胞的存活率大于100%，且在50 μg/mL和100 μg/mL濃度下可刺激RAW264.7細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)膜苞鳶尾的不同極性部位對(duì)細(xì)胞均無毒性作用。

2.2 RAW264.7炎癥細(xì)胞NO生成量測定結(jié)果

在確定膜苞鳶尾不同極性部位的無毒性劑量范圍后，研究了膜苞鳶尾不同極性提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞NO生成量的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)細(xì)胞未受到外界LPS刺激時(shí)，細(xì)胞基本不表達(dá)NO；在終濃度為1 μg/mL的LPS刺激24 h后，細(xì)胞NO含量明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞后，能誘導(dǎo)細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)NO。經(jīng)過膜苞鳶尾不同極性部位作用后，巨噬細(xì)胞中NO的釋放受到不同程度的抑制，且5種提取物的抑制作用均呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。當(dāng)藥物濃度為5～20 μg/mL時(shí)，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、水部位NO生成量明顯降低（P＜0.001）。當(dāng)濃度為5 μg/mL時(shí)，抑制NO的效果為石油醚部位＞乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞水部位；當(dāng)藥物濃度為15 μg/mL時(shí)，抑制NO的效果為乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞石油醚部位＞水部位；當(dāng)藥物濃度為20 μg/mL時(shí)，抑制NO的效果乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞石油醚部位＞水部位。當(dāng)藥物濃度在50～200 μg/mL時(shí)，正丁醇部位才能夠顯著抑制炎癥模型細(xì)胞中NO的生成，說明正丁醇部位抗炎效果最差。

圖1 膜苞鳶尾不同極性部位對(duì)RAW264.7炎癥細(xì)胞活力的影響

膜苞鳶尾根狀莖乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷部位抗炎活性較強(qiáng)，分析原其因可能是因?yàn)橄嗤|(zhì)量下的不同極性部位的浸膏，極性小的部位所含的黃酮類成分較高，而極性大的水和正丁醇部位中因含有大量的多糖類成分，黃酮類含量相對(duì)較低，因此抗炎活性較弱。

圖2 膜苞鳶尾不同極性部位對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響

3 結(jié)論

膜苞鳶尾的不同極性部位對(duì)細(xì)胞均無毒性作用，且乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷部位抗炎活性較強(qiáng)，這為后續(xù)抗炎活性導(dǎo)向下的單體分離以及藥理研究工作提供了理論依據(jù)。