楊神州

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約1/10的育齡期夫婦不能正常生育后代，主要原因之一是男性因素引起的不育[1]。Y染色體微缺失是男性不育的原因之一[2]。

目前Y染色體AZF微缺失檢測的方法很多。歐洲男科學(xué)會（EAA，European Academy of Andrology）和歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟（EMQN，European Molecular Genetics Quality Network）發(fā)布了Y染色體微缺失的分子診斷指南，指出對特異性標(biāo)簽位點（STS，Sequence tagged sites）進行擴增具有簡單、快速、靈敏、特異的特點，是檢測AZF缺失的理想方法[3]。目前，多重定性PCR法和實時熒光定量PCR都是基于檢測STS來確定是否有已知的缺失，該方法操作簡單，檢測周期相對較短[4-5]，但需要DNA提取等過程。

近年來，出現(xiàn)了很多核酸恒溫擴增技術(shù)，如核酸依賴性擴增檢測、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增、鏈替代擴增、滾環(huán)擴增、依賴解旋酶的恒溫基因擴增及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)等，反應(yīng)時間短、特異性好、不需復(fù)雜儀器設(shè)備等特點是傳統(tǒng)PCR難以超越的[6-7]。相對其他核酸恒溫擴增技術(shù)來說，重組酶聚合酶擴增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）技術(shù)具有不需熱變性、引物設(shè)計相對較簡單、在25～42 ℃恒溫條件下可快速完成核酸擴增等諸多優(yōu)點[8]。RPA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測、病原微生物、食品安全等多個領(lǐng)域[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

收集4名志愿者的血液樣本，其中男女各2名。這4名志愿者中，2名男性均無7個STS（sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY14）缺失，女性均無以上STS。

1.2 試劑和儀器

天根基因組DNA提取試劑盒；Chelex-100，北京索萊寶；通用一步法DNA提取液，上海生工；2×GoldStar Best MasterMix PCR擴增試劑，康為世紀；RPA試劑，TwistDx公司。

ABI2720 PCR儀，Applied Biosystems；NanoDrop 2000超微量分光光度計，Thermo Fisher，用于測定A260/230和A260/A280以及核酸濃度。

1.3 實驗引物

引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，PCR引物序列參考EAA和EMQN發(fā)布的Y染色體微缺失分子診斷指南。RPA引物根據(jù)RPA引物設(shè)計原則設(shè)計，具體設(shè)計原則為：5′端3～5個核苷酸避免聚鳥嘌呤（G），最好為胞嘧啶（C）；3′端3個核苷酸是G或C，有助于聚合酶的穩(wěn)定性；不要出現(xiàn)聚嘌呤和嘧啶；GC含量在30%～70%；避免形成二級結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等；靶標(biāo)區(qū)域避開重復(fù)元件，引物序列見表1

1.4 裂解條件

裂解條件1：5 μL血液樣本中加入45 μL 5 mmol/L的NaOH溶液，90 ℃孵育2 min。

裂解條件2：5 μL血液樣本中加入45 μL溶液A（NaOH濃度為5 mmol/L，Chelex-100濃度為5%），90 ℃孵育 2 min。

裂解條件3：5 μL血液樣本中加入45 μL通用一步法DNA提取液，80 ℃加熱2 min。

1.5 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系條件參考EAA和EMQN發(fā)布的Y染色體微缺失分子診斷指南。

RPA反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Reaction Buffer 12.5 μL，10 mmol/L dNTPs 4.6 μL，10×Basic E-mix 2.5 μL，10 μmol/L引物A和10 μmol/L引物B各1.2 μL，20×Core Reaction 1.25 μL，混勻后加入1.25 μL的280 mmol/L MgOAc和1 μL DNA模板。39 ℃反應(yīng)30 min。

1.6 產(chǎn)物的檢測

取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺（TAE）電泳緩沖液瓊脂糖中電泳，200 V電泳25 min。

RPA產(chǎn)物中加入25 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺緩沖液（TE buffer），混勻后98 ℃孵育1 min。取5 μL產(chǎn)物用1.5% TAE瓊脂糖電泳，200 V電泳25 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 裂解條件的選擇

裂解和提取的DNA經(jīng)Qubit和紫外分光光度計檢測，濃度和檢測結(jié)果如表2所示。裂解條件1和裂解條件2提取濃度差別不大，濃度最高；天根試劑盒提取濃度次之，裂解條件3提取濃度最低。A260/230和A260/A280顯示天根試劑盒提取的DNA純度最高，裂解條件1～3得到的DNA純度較低。

表1 STS引物列表

表2 不同提取方法的濃度和吸光度

圖1顯示不同提取方法提取血液DNA經(jīng)過選用sY255引物組進行RPA擴增之后電泳的條帶。結(jié)果顯示，裂解條件1、裂解條件2、天根試劑盒提取后擴增產(chǎn)物清晰可見，極易辨別，裂解條件3的擴增產(chǎn)物有微量條帶出現(xiàn)，血液直接為模板的擴增無產(chǎn)物出現(xiàn)?？紤]到裂解條件2中的Chelex-100極易沉降，在實際檢測中不方便，所以在后續(xù)實驗中選擇條件1進行檢測。

圖1 不同提取方法的擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 引物特異性檢測

男性和女性血液樣本按照裂解條件1裂解后，分別取1 μL作為模板進行RPA擴增，正常男性樣本每個STS都擴增出了清晰的目的條帶，而正常女性樣本均未見目的條帶，凝膠圖像見圖2。

圖2 引物特異性檢測電泳圖

3 結(jié)論

使用快速堿裂解法提取DNA，并沒有經(jīng)過酶解、洗滌等過程，證明了血液通過該方法可以快速地用于RPA，解決了血液樣本對RPA抑制這一問題。該研究進一步將Y染色體微缺失檢測和RPA結(jié)合，證明在操作簡單、儀器需求程度低的情況下，核酸裂解僅需2 min，擴增不超過30 min，產(chǎn)物變性和電泳不超過27 min，1 h內(nèi)即可檢測出結(jié)果，實現(xiàn)了Y染色體微缺失的快速檢測。