張 苗，紀(jì) 峰，陳友義

(福建中醫(yī)藥大學(xué)， 福州 350112)

隨著人口老齡化日趨明顯，衰老成為目前人們研究的熱門。衰老被認(rèn)為是生理功能的衰退或惡化，通常由于基因組的累計變化，端粒長度的減少，蛋白質(zhì)和細(xì)胞損傷，炎癥和細(xì)胞衰老，內(nèi)源性干細(xì)胞的耗盡[1]，導(dǎo)致皮膚老化的原因很多，包括紫外線(UV)損傷、環(huán)境污染、炎癥、活性氧的增加以及衰老[2-3]?？偟膩碚f，這些不同來源造成的損害會導(dǎo)致表皮組織的退化和損傷以及膠原蛋白和彈性蛋白的喪失，其中衰老也被認(rèn)為是表皮厚度和生長因子下降的主要原因[4]，同時皮膚衰老與氧化過程也存在關(guān)系。

“治未病”是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的重要組成部分，對后世影響深遠(yuǎn)。逆灸是指在機體無病或疾病發(fā)生之前，預(yù)先應(yīng)用針灸方法激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，增強機體的抗病與應(yīng)變能力，從而防止疾病的發(fā)生、減輕隨后疾病的損害或保健延年的傳統(tǒng)方法。依據(jù)疾病預(yù)防原則而應(yīng)用逆灸的手段來“治未病”是針灸學(xué)的重要內(nèi)容。足三里穴是常用的保健要穴，是足陽明胃經(jīng)的合穴、胃之下合穴、回陽九針穴之一。《針灸真髓》曰：“三里養(yǎng)后天之氣，灸三里可使元氣不衰，故稱長壽之灸。[5-6]”

本實驗選取自然衰老大鼠模型，采用目前艾灸動物實驗中普遍采用的方法，觀察艾灸足三里對皮膚抗老化能力的影響，以期為檢驗古方、指導(dǎo)臨床提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

S-680B全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)；FS-200塑料薄膜封口機(臨安銘偉包裝機械設(shè)備廠)；Mini-PROTEAN? Tetra電泳槽(BIO-RAD公司)；NanoDrop 2000c微量分光分度計(美國ThermoFisher公司)；CKX 41實驗室倒置生物顯微鏡(日本OLYMPOS公司)；SOD和MDA試劑盒(南京建成)；collagenⅠ/Ⅲ抗體(華安生物)；RIPA裂解液(上海生物工程股份公司)。

1.2 實驗動物

SPF級SD雌性健康大鼠48只，其中青年組6只，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g；10月齡42只，體質(zhì)量(400±220)g，按隨機數(shù)字表法分為10個月、12個月、14個月、16個月對照組以及12個月、14個月、16個月艾灸組，每組各6只；各組動物在同等條件下常規(guī)喂食，放置光照充足、通風(fēng)良好的地方，溫度保持在(24±2)℃，濕度保持在40%～60%。

1.3 取穴及艾灸方法

艾灸組每周灸足三里4次，持續(xù)2個月、4個月和6個月，對照組每周相同時間抓取但不灸，亦不讓其聞到艾灸的味道。

大鼠足三里穴定位參照大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜。足三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處。艾灸前將穴區(qū)直徑約1.0 cm左右的鼠毛剪干凈，用大鼠固定器將大鼠固定，暴露穴區(qū)皮膚。艾柱底盤直徑為0.7 cm，艾柱直徑為0.1 cm，重1.0 g，將艾柱黏貼在穴區(qū)，小孔對準(zhǔn)穴位點燃艾柱，每次灸10 min，灸后局部皮膚略紅，無發(fā)泡。

1.4 取材及標(biāo)本處理

大鼠于3、10、12、14、16月齡分別取材。取材前1 d用配置的8%硫化鈉溶液脫去兩肩胛至髂骨之間背部皮膚的毛。第2天大鼠處死后，剪取大鼠背部脫毛皮膚適量分成三部分：第一部分皮膚置于中性多聚甲醛中固定，24 h后常規(guī)脫水、透明、封片；第二部分皮膚用預(yù)冷生理鹽水(4 ℃)沖洗，除凈雜質(zhì)，濾紙拭干，切取皮膚0.5 g放入盛有2.0 mL預(yù)冷生理鹽水的小燒杯內(nèi)，剪碎后制成10%勻漿；第三部分用錫箔紙包好放入液氮中，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 各組大鼠皮組織H&E染色(×100)

1.5 H&E染色檢測皮膚病理變化

將新鮮的皮膚組織浸泡于4%的中性多聚甲醛包埋于蠟塊中，切片徹底脫蠟后進(jìn)行H&E染色。

1.6 ELISA法檢測大鼠皮膚勻漿中雌二醇水平

準(zhǔn)確稱取3、10、12、14、16月齡皮膚質(zhì)量，按體質(zhì)量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍體積的PBS，冰水浴條件下機械勻漿制備成10%的勻漿液，2500～3000 r/min離心10 min，去上清按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 皮膚組織MDA含量測量

MDA(丙二醛)是常用的過氧化標(biāo)志物，在高溫和酸性條件下可與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅棕色的三甲川，其生成物在532 nm 處有最大吸收波長。準(zhǔn)備足夠多的1.5 mL EP管，按MDA試劑盒說明書進(jìn)行實驗。

1.8 皮膚組織SOD活力測量

SOD(超氧化物歧化酶)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)如動物、植物、微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)，按SOD試劑盒說明書進(jìn)行實驗。

1.9 qPCR檢測多種生長因子表達(dá)水平

取各組大鼠皮膚組織，使用Trizon試劑提取皮膚RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR檢測VEGF、EGF、TGF-β、ERβ、bFGF的基因表達(dá)水平。引物序列如下：VEGF: F：5’-GCACTGGACCCTGGCTTTACT-3’, R：5’-ACTTCACCACTTCATG GGCTTTCTG-3’； EGF: F：5’-TCGGTGCTGTGCGATTTA-3’, R：5’-TTTCTGGCAGTTCTCCTC-3’； TGF-?1 F： 5’-ACTACGCCAAAGAAGTCACC-3’，R: 5’-CACTGCTTCCCGAATGTCT-3’; FGF F: 5’-ATTTCCAAAACCTGACCCGAT-3’, R: 5’-TGCCTTTTAACACAACGACCAG-3’。

1.10 Western Blot 檢測膠原蛋白表達(dá)水平

Western Blot檢測膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的蛋白含量：一是清洗玻璃板并安裝好，然后灌水檢漏、配膠；二是電泳：以濃縮膠電壓為70 V和分離膠電壓為120 V的條件進(jìn)行電泳；三是將膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；本是封閉1～2 h后用一抗過夜孵育，然后用TBST洗膜3次，每次10 min，用二抗孵育1～2 h，再用TBST洗膜3次，每次10 min，最后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 艾灸具有保護(hù)大鼠皮膚的作用

圖1示，組織病理學(xué)可以客觀真實地反映組織損傷的嚴(yán)重程度。3個月青年組、10個月對照組和12個月、14個月、16個月艾灸組表皮、真皮結(jié)構(gòu)及毛囊完好無損，而12個月、14個月、16個月衰老組大鼠隨著年齡的增加，表皮細(xì)胞和毛囊上皮細(xì)胞腫脹，核固縮，存在充血性血管反應(yīng)和炎癥細(xì)胞浸潤。

圖2示，皮膚馬松染色反映皮膚中膠原蛋白的含量，3個月青年組、10個月對照組和12個月、14個月、16個月艾灸組膠原蛋白含量多，排列整齊；12個月、14個月、16個月衰老組膠原纖維性水腫導(dǎo)致排列紊亂，以上結(jié)果說明艾灸具有保護(hù)大鼠皮膚的作用。

注：箭頭所示為膠原蛋白圖2 各組大鼠皮膚組織馬松染色結(jié)果(×100)

2.2 艾灸對皮膚的氧化應(yīng)激、含水量、雌二醇含量及膠原蛋白表達(dá)的影響

表1示，衰老會伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，通過檢測抗氧化標(biāo)志物過氧化物歧化酶(SOD)和氧化標(biāo)志物丙二醛(MDA)來研究艾灸對氧化應(yīng)激的影響。艾灸可以增加皮膚中SOD的活力，減少MDA的含量(P<0.05)，說明艾灸可以減少衰老帶來的皮膚氧化。

皮膚干濕重比值與皮膚含水量和通透性有很大的關(guān)系，皮膚的衰老也會直接導(dǎo)致皮膚含水量下降。表1可知，與衰老各組大鼠比較，艾灸各組大鼠的皮膚含水量顯著性增加(P<0.05)，說明艾灸增加皮膚含水量和通透性達(dá)到減緩衰老的作用。

皮膚的衰老與雌二醇的下降有很大的關(guān)系，通過ELISA檢測皮膚勻漿中雌二醇的表達(dá)量，從表1可以看出，3個月青年組和10個月對照組的雌二醇含量比較高，隨著年齡的增加，雌二醇的含量有顯著性下降；而各艾灸組大鼠皮膚的雌二醇含量相比于同月齡對照組有所增加(P<0.05)，說明艾灸可以通過增加皮膚雌二醇含量減緩衰老。

皮膚膠原蛋白的含量也是檢測皮膚衰老的一個重要指標(biāo)，嬰兒及青年人皮膚Ⅲ型膠原含量約占70%，Ⅰ型膠原蛋白占30%。當(dāng)皮膚衰老時，兩者比例逐漸倒置，膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降，抗剪切力減弱。通過Western Blot 檢測皮膚中膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ的含量，從表1可以看出，3個月青年組和10個月對照組的膠原蛋白Ⅲ含量很高，膠原蛋白Ⅰ含量很少，與各衰老組比較，艾灸可以顯著性增加皮膚膠原蛋白Ⅲ的含量(P<0.05)，說明艾灸通過增加皮膚膠原蛋白Ⅲ的含量減緩皮膚衰老。

表1 各組大鼠皮膚組織雌二醇含量、干濕重比值、膠原蛋白含量、SOD活力和MDA含量比較

2.4 艾灸對皮膚中生長因子含量的影響

表2示，皮膚中的生長因子與皮膚衰老也有很大的關(guān)系，通過qPCR檢測各組大鼠生長因子VEGF、EGF、TGF-β、Erβ和bFGF mRNA的表達(dá)水平，3個月青年組和10個月對照組各種生長因子表達(dá)量較高，隨著年齡的增加生長因子表達(dá)量下降；經(jīng)艾灸治療的老齡鼠生長因子的表達(dá)有所升高(P<0.05)，說明艾灸可以增加皮膚中生長因子的含量。

表2 各組大鼠皮膚組織生長因子mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

中醫(yī)傳統(tǒng)理論謂之“美容顏”“好顏色”“健肌膚”“駐顏”“烏須發(fā)”“耐老”等。延緩皮膚水牢屬于中醫(yī)“養(yǎng)生”學(xué)范疇。中醫(yī)對皮膚衰老的研究存在以下機理：“以腎為本，注重五臟”“氣血津液，密切相關(guān)”“六淫七情，亦可致衰”。張仲景在《金匱要略》中提出：“夫治未病者，見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實脾”。因此，“治未病”應(yīng)包含未病先防、早期治療、已病防變等涵義。它的最終目的應(yīng)是防病防變、保健延年。逆針灸一詞首見明·高武《針灸聚英》：“無病而先針灸曰逆。逆，未至而迎之也”。 金曉哲等[14-15]實驗結(jié)果表明，針刺足三里能提高光老化模型大鼠皮膚組織中SOD的活性，對紫外線照射引起的無毛鼠皮膚光老化具有保護(hù)作用。華巖等[16]探討艾灸足三里穴對小鼠腎臟組織抗氧化損傷的影響，發(fā)現(xiàn)能提高骨骼肌組織中GSH-Px、SOD的活性，清除自由基，阻止加快的過氧化反應(yīng)。白巍等[17]實驗表明，針刺足三里、關(guān)元穴能明顯增強更年期雌性大鼠卵巢組織抗氧化、清除自由基的能力，改善和調(diào)節(jié)卵巢生理功能，從而延緩卵巢的衰老進(jìn)程。楊春英等[18]針灸亞急性衰老模型小鼠足三里后，小鼠皮膚組織中的丙二醛(MDA)含量減少，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力增強，羥脯氨酸(Hyp)含量增多，提示針灸足三里穴對小鼠皮膚衰老具有拮抗作用。研究表明[19]，針灸衰老模型小鼠的足三里穴，能提高機體自身抗自由基氧化損傷的能力，減輕淋巴細(xì)胞DNA的損傷程度，使小鼠腦組織Bcl-2基因表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡，減少皮膚組織中的丙二醛(MDA)含量，增強谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力，增多羥脯氨酸(Hyp)含量，從而達(dá)到延緩衰老的目的。

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究中，皮膚的老化過程中有多種生長因子如VEGF、EGF、TGF-β、FGF等起著重要的保護(hù)和修復(fù)作用[7]。皮膚衰老研究證實，膠原是人體細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，膠原纖維約占真皮纖維的90%。研究表明，隨著年齡增長，皮膚膠原纖維變細(xì)，真皮層變薄。一般嬰兒及青年人皮膚Ⅲ型膠原含量約占70%，Ⅰ型膠原蛋白占30%。 當(dāng)皮膚衰老時兩者比例逐漸倒置，膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降，抗剪切力減弱[14]。 膠原蛋白總含量減少，特別是可溶性膠原含量下降明顯，同時真皮乳頭層和網(wǎng)狀層彈性纖維減少及退化，膠原纖維和彈性纖維排列也漸趨紊亂，引起皺紋、松弛及下垂[8-9]。雌激素參與了皮膚的許多生理及病理過程，人類皮膚老化與體內(nèi)性激素水平降低有關(guān)。絕經(jīng)期出現(xiàn)卵巢周期性排卵及激素周期終止，雌激素下降明顯，由原來的0.350 mg/d下降至0.045 mg/d，絕經(jīng)期婦女由于卵巢的內(nèi)分泌功能減退，血中雌二醇(E2)水平下降90%，雌酮(E1)下降50%[10]。脫氫表雄酮及硫酸脫氫表雄酮逐步下降，最終導(dǎo)致卵巢基質(zhì)耗竭(70歲左右)[11-12]。正常皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)雌激素受體(ER)，雌激素可直接調(diào)控該細(xì)胞的增殖，提高其活性，增加膠原含量[13]。

本實驗在衰老大鼠模型中，利用艾灸進(jìn)行治療可以明顯緩解老齡大鼠的皮膚衰老。通過H&E和馬松染色在組織病理學(xué)方面發(fā)現(xiàn)，艾灸可以保護(hù)表皮和真皮結(jié)構(gòu)以及毛囊的完整性；通過檢測SOD活力和MDA含量發(fā)現(xiàn)，艾灸在衰老的皮膚中具有抗氧化的作用，抑制氧化應(yīng)激從而達(dá)到保護(hù)皮膚的作用；qPCR和ELISA的方法檢測大鼠皮膚組織中生長因子和雌二醇的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，艾灸可以有效地增加多種生長因子和雌二醇的含量，說明艾灸通過增加生長因子和雌二醇的含量來延緩大鼠皮膚衰老；最后利用Western Blot方法進(jìn)一步驗證艾灸可以有效地促進(jìn)皮膚組織中膠原蛋白表達(dá)。

綜上所述，實驗說明艾灸可以降低皮膚的炎癥和氧化水平，增加衰老皮膚的膠原蛋白含量和雌二醇水平。本實驗艾灸組共分為逆灸2個月、4個月和6個月3組。從實驗結(jié)果可以看出，逆灸2個月后皮膚的衰老程度具有輕微延緩，逆灸4個月時老齡大鼠皮膚的衰老程度具有顯著性緩解，逆灸6個月與4個月無明顯變化，說明逆灸4個月就已經(jīng)足夠緩解老齡鼠的皮膚衰老程度，本實驗為臨床緩解皮膚衰老提供了新的方法與思路。