陳婭萍 陸紫云 宋雙 張婷 張?zhí)焯? 崔浩

摘要：在早期胚胎發(fā)育過程中，哺乳動物肺發(fā)育經(jīng)歷了氣管分支形態(tài)發(fā)生、上皮管道形成、血管生成、肺泡分化等過程。這些過程受到各種激素、生長因子以及形態(tài)發(fā)生素等蛋白的嚴格調控。硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）是一類高度異質性的帶負電荷的大分子糖胺聚糖，其主要位于細胞表面以及細胞間質中。HS通過與蛋白相互作用參與哺乳動物發(fā)育過程。多年來，大量研究工作表明，HS與多種生長因子、趨化因子、形態(tài)發(fā)生素等蛋白結合后參與肺發(fā)育過程的調控。本文根據(jù)目前最新的研究進展，闡述了HS糖鏈精細結構與肺發(fā)育過程的關系。

關鍵詞：硫酸乙酰肝素;哺乳動物肺發(fā)育;功能

一、哺乳動物肺發(fā)育

從胚胎發(fā)育成為具有自主呼吸能力的新生兒是哺乳動物如人類發(fā)育的重要過程。在子宮內，胚胎肺部血流量低，氧合作用主要通過胎盤的氣體交換完成。出生后，新生兒心血管循環(huán)模式發(fā)生改變，肺部血流量大幅增高，從而代替胎盤進行氣體交換。然而，如果肺部發(fā)育不成熟或肺部發(fā)生損傷，可造成肺泡表面積減少，肺血流供應不足，導致氣體交換功能受損和新生兒呼吸衰竭的發(fā)生[1]。

哺乳動物肺首先從內胚層前腸以上皮肺芽的形式出現(xiàn)。原始的肺芽不斷生長延伸到周圍間質中，形成相互連通的各級氣管并在細支氣管末端形成短管束。短管束進一步分支后擴展形成終末導管，與此同時肺泡和血管開始發(fā)育，終末導管進一步擴大構成原始肺泡。原始肺泡分隔和重建后，肺泡數(shù)量和表面積大幅增加，形成成熟的肺泡[2]。大量研究表明肺分支形成過程中，上皮與間充質之間的相互作用至關重要，肺上皮生長和分化受到發(fā)自間充質的信號的調控。在此過程中，相關基因的表達受到各種轉錄因子和生長因子的時空調控[3]。

二、硫酸乙酰肝素

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS），是一類結構復雜的含有硫酸基團的帶負電荷的糖胺聚糖。HS與核心蛋白共價結合形成蛋白聚糖（proteoglycan）（如Syndycans，Glypicans和Perlecan等），廣泛存在于細胞表面和細胞外基質中。大量研究顯示，HS糖鏈可與上百種蛋白如生長因子、細胞因子等相互結合，參與胚胎發(fā)育，正常生理平衡以及老年癡呆、病毒感染、炎癥、腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉移等多種生理病理過程的調節(jié)。HS與各種蛋白結合的能力與其糖鏈的精細結構密切相關[4]。

HS糖鏈的生物合成是通過多達20多種催化酶在高爾基體內對底物的協(xié)調加工完成的。首先，特征四糖片段（GlcAGalGalXyl）在糖基轉移酶的作用下與核心蛋白的絲氨酸（Ser）殘基連接。而后，聚合酶EXT1/EXT2催化延伸HS糖鏈形成由[GlcAβ1，4GlcNAcα1，4]二糖重復單元組成的骨架糖鏈。最后經(jīng)過一系列的修飾反應，包括GlcNAc的N去乙酰N硫酸化（NDST），GlcA差向異構化為IdoA（HSepi），己糖醛酸C2位的硫酸化（2OST），以及葡萄糖胺的C6位（6OST）和C3位（3OST）的硫酸化。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種NDST同工酶，3種6OST和7種3OST，1種HSepi和2OST，參與人體細胞HS糖鏈的修飾。HS糖鏈的修飾反應具有一定的時序性，例如，起始修飾階段，關鍵酶NDST對GlcNAc進行N脫乙酰N硫酸化形成N硫酸化結構域后才能夠被C5差向異構化和O硫酸化修飾[4]。

三、HS糖鏈結構高度多樣化

HS生物合成的復雜性決定了其結構和生物學功能的多樣性，這些HS糖鏈結構和功能的差異是由于參與HS合成的酶的表達譜在不同生理或病理狀態(tài)（如組織/細胞類型、分化、生長或病理狀態(tài)）下的差異決定的。例如在小鼠胚胎發(fā)育過程中，HS糖鏈存在發(fā)育階段和組織特異性的結構改變。未分化的胚胎干細胞顯示低硫酸化修飾的HS結構，而分化的神經(jīng)前體細胞表達較高硫酸化的HS，其中糖鏈的N和6O硫酸化修飾程度顯著提高。研究顯示，在小鼠大腦胚胎發(fā)育過程中，HS糖鏈的鏈長和硫酸化修飾模式呈動態(tài)變化[5]。

四、HS糖鏈在肺發(fā)育中的作用

肺發(fā)育過程中，大量細胞生長因子、形態(tài)發(fā)生素等蛋白通過介導上皮間充質相互作用，從而誘導上皮分化和促進肺間充質的增殖、分化和模式化。研究顯示，HS糖鏈通過與這些蛋白因子相互結合，調節(jié)其運輸過程或生物活性，從而參與肺部發(fā)育。HS糖鏈修飾酶發(fā)生突變可導致肺發(fā)育缺陷。例如，NDST1基因敲除小鼠表現(xiàn)嚴重的腦部、面部、眼睛和骨骼發(fā)育異常，突變小鼠出生后迅速死于肺功能不全。進一步研究顯示，敲除NDST1基因可導致肺泡間隔增厚以及II型肺細胞成熟障礙（分泌表面活性蛋白以啟動和維持肺泡擴張）。在果蠅中，NDST1同源物sulfateless突變可引起氣道發(fā)育障礙。機理研究表明，sulfateless突變顯著降低了FGF誘導的MAPK信號通路活性，從而導致氣管細胞遷移和分支形態(tài)發(fā)生缺陷。我們的研究結果表明，敲除C5差向異構酶基因HSepi后，細胞合成的HS糖鏈僅含有GlcA而不含IdoA。HSepi敲除小鼠具有腎臟發(fā)育不全、骨骼畸形、眼睛發(fā)育缺陷和肺發(fā)育不成熟等表型，出生后由于呼吸窘迫而死亡。HS糖鏈6O硫酸化修飾在氣管發(fā)育中同樣重要，利用RNAi抑制果蠅6OST表達可降低FGF誘導的MAPK信號通路活性，導致氣管分支障礙和胚胎死亡。然而，在小鼠模型中，敲除6OST1基因對小鼠胚胎肺發(fā)育或分支形態(tài)發(fā)生沒有影響，但小鼠出生后，表現(xiàn)肺泡發(fā)育缺陷、肺泡體積和不規(guī)則彈性蛋白沉積增加等癥狀[6，7]。

利用胚胎肺組織塊體外培養(yǎng)模型，多個實驗室證明了HS糖鏈在肺形態(tài)發(fā)生中的重要功能。利用肝素酶裂解E11.5小鼠上皮組織塊中（無間充質）的HS糖鏈可致其迅速死亡，而未添加FGF10生長因子培養(yǎng)的肺可導致類似現(xiàn)象，這表明去除HS糖鏈可能破壞了FGF信號轉導從而導致肺發(fā)育障礙。與此呼應，研究顯示，在E11E13胚胎小鼠肺中，F(xiàn)GF10蛋白的表達與肺分支活躍區(qū)域中HS糖鏈表達相關。此外，在肺上皮細胞或全肺組織塊培養(yǎng)基中添加肝素可改變FGFs誘導的形態(tài)發(fā)生的活性。體外肺組織塊培養(yǎng)試驗結果顯示，低劑量肝素可一定程度上增強上皮分枝。而高濃度肝素處理可同時調控支氣管平滑肌細胞分布和分支形態(tài)發(fā)生。同樣利用肺組織塊體外培養(yǎng)模型，通過氯酸鈉抑制HS糖鏈硫酸化或在培養(yǎng)基添加過量的O硫酸化肝素可干擾FGF10與上皮細胞結合以及FGF10的生物活性，最終抑制BMP4的表達和阻礙肺分支的形成。此外，向氯酸鈉處理的肺組織塊培養(yǎng)基中添加僅含N硫酸化修飾的肝素（去O硫酸化）不能恢復FGF依賴的生存和生長，而添加過量或部分O硫酸化修飾的肝素可以修復氯酸鈉處理導致的肺分支障礙。這些證據(jù)表明O硫酸化修飾對HS糖鏈參與肺部的發(fā)育至關重要[6，7]。

五、結語

HS糖鏈通過儲存或聚集各種生長因子以及充當受體或輔助受體等多種機制調控細胞信號的轉導，從而參與分支器官特別是肺發(fā)育的過程。HS的調節(jié)功能受到其糖鏈精細結構的影響。因此，闡明HS糖鏈結構與肺部發(fā)育關系可為靶向生長因子或者細胞層面的肺組織再生和修復研究提供重要參考。

參考文獻：

[1]Kinsella，J.P.，A.Greenough，and S.H.Abman，Bronchopulmonary dysplasia.Lancet，2006，367（9520）：14211431.

[2]Metzger，R.J.，et al.，The branching programme of mouse lung development.Nature，2008，453（7196）：745U1.

[3]Warburton，D.，Developmental biologyOrder in the lung.Nature，2008，453（7196）：733735.

[4]J.P.Li，M.K.G.，Heparan Sulfate Biosynthesis，Structure，and Function International Review of Cell and Molecular Biology，2016，325：215273.

[5]Poulain，F(xiàn).E.and H.J.Yost，Heparan sulfate proteoglycans：a sugar code for vertebrate development？ Development，2015，142（20）：345667.

[6]Patel，V.N.，D.L.Pineda，and M.P.Hoffman，The function of heparan sulfate during branching morphogenesis.Matrix Biol，2016.

[7]Thompson，S.M.，et al.Heparan sulfate in lung morphogenesis：The elephant in the room.Birth Defects Res C Embryo Today，2010，90（1）：3244.

基金項目：2018年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（項目編號：201810414010）

作者簡介：陳婭萍（2000—），女，漢族，湖南耒陽人，本科，研究方向：糖生物學。

*通訊作者：崔浩（1985—），男，漢族，江蘇人，博士，副教授，研究方向：糖生物學。