錢 坤 ，李青春，安同偉 ，田向?qū)W，楊慧杰 ，沈永鑫

（ 1. 天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，天津 300402；2. 天津赫萊恩特生物科技有限公司，天津 301702；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300384；4.遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽110016；5.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，北京 100020）

普洱曬青茶是采摘的普洱茶鮮葉經(jīng)攤涼、殺青、揉捻和干燥制作而成，是制作普洱熟茶和普洱生茶的原料，并在地理保護范圍內(nèi)采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質(zhì)特征的茶葉，按其加工工藝的不同，普洱茶可分為普洱熟茶和普洱生茶[1]。其安全性直接影響普洱茶相關產(chǎn)品的安全性。農(nóng)藥殘留檢測大多需采用多種前處理方法，往往面臨處理時間長、程序復雜等缺陷，樣品的前處理（樣品制備）是其分析的關鍵和難點，直接影響目標分析物準確性、成本和效率[2]。由于茶葉自身含有大量的茶多酚、茶色素、茶多糖、茶氨酸等成分，會嚴重影響農(nóng)藥殘留的檢測，對目標物帶來干擾[3]。本研究采用HS-SPME技術結合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立普洱曬青茶中多種農(nóng)藥殘留的快速檢測方法，對影響HS-SPME技術的萃取頭類型及其他影響因素進行考察和優(yōu)化，并對云南省普洱市主要產(chǎn)區(qū)的普洱曬青茶進行檢測。

傳統(tǒng)提取方法有液液萃取法（LLE）、索氏提?。⊿E）、超臨界流體萃?。⊿FE）、加速溶劑提?。ˋSE）等方法，這些方法易于推廣、應用普遍，但是傳統(tǒng)前處理方法普遍存在操作繁瑣、溶劑用量大、選擇性差、自動控制率低、消耗時間長等缺點。隨著前處理技術水平的不斷提升，高效、快速、少溶劑的樣品前處理新技術和新方法不斷的涌現(xiàn)，其中常見的有：固相萃?。⊿PE）[4]、液相微萃?。↙PME）[5]、分散固相萃?。―SPE）[6]、基質(zhì)固相分散萃?。∕SPD）、攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）[7]、固相微萃?。⊿PME）[8]等萃取技術，這些新技術的出現(xiàn)，有效的克服了傳統(tǒng)前處理方法的缺陷，具備操作簡單、萃取效率高、自動化程度高、省時省力、較少使用或無溶劑等優(yōu)點。SPME技術作為新型的無溶劑樣品前處理技術，在簡化操作流程、節(jié)省有機溶劑消耗、減少環(huán)境污染和降低勞動力消耗等方面具有獨特的優(yōu)勢，完全具備分析領域所倡導的“綠色分析”技術特點。目前，該技術在簡單基質(zhì)中單一幾種或少數(shù)幾類痕量化學污染物檢測中有廣泛應用，但對于茶葉這種復雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留的研究尚未有報道。本研究以國家普洱茶質(zhì)量技術監(jiān)督檢測中心的長期檢測為參考，篩選出21種常見農(nóng)藥，采用具有高靈敏度、高選擇性和良好重現(xiàn)性的GC-MS檢測技術，并且針對普洱曬青茶基質(zhì)特點，采用頂空固相微萃取（HS-SPME）前處理技術凈化基質(zhì)，濃縮分析物，并對儀器測定參數(shù)和前處理條件進行優(yōu)化，以提高檢測方法的選擇性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品：曬青茶購自普洱市茶葉交易市場?？瞻讜袂嗖铇悠罚航?jīng)國家普洱茶質(zhì)量技術監(jiān)督檢測中心檢測，未檢測出目標農(nóng)藥殘留，本樣品用作頂空固相微萃取條件優(yōu)化空白基質(zhì)樣品。

有機溶劑：乙腈（色譜純）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲苯（色譜純），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。無機鹽：氯化鈉（分析純），購自天津市北方天醫(yī)化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

島津氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMSQP2020），日本島津公司生產(chǎn)。島津毛細管色譜柱（SH-Rxi-17 Sil MS，30 m × 250μm ×0.25 μm），日本島津公司生產(chǎn)。手動固相微萃取手柄（SPME-GC），美國Supelco公司生產(chǎn)。磁力攪拌器（IT-09A），上海一恒科學儀器有限公司生產(chǎn)。電子天平（YP1200型），上海精科電子有限公司生產(chǎn)。移液槍，德國 Eppendorf公司生產(chǎn)。Milli-Q高純水發(fā)生器（Tankmpk 01），美國Millipore公司生產(chǎn)。85 μm PA萃取頭、65 μm PDMS/DVB萃取頭，購自美國Supelco公司。20 mL頂空瓶，購自日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品預處理 曬青茶樣品和曬青茶空白基質(zhì)樣品經(jīng)粉碎后過20目篩，粉碎后茶葉裝入鋁箔紙封袋中，放置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 標準溶液的配制 根據(jù)21種農(nóng)藥標準品的濃度進行稀釋到合適的含量作為分析用標準液。

1.3.3 GC-MS條件 （1）GC條件 色譜柱：SHRxi-17 Sil MS，30 m × 250 μm × 0.25 μm毛細管柱。

載氣：高純氦氣（＞99.999%）；載氣流速：1.1 mL·min-1。

進樣方式：手動進樣；進樣模式：不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃。

色譜柱升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃每1 min升至160 ℃，再以5 ℃每1 min升至295 ℃，保持10 min。

（2）MS條件 離子化模式：EI源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：290 ℃。

質(zhì)譜掃描方式：全掃描模式（SCAN），掃描質(zhì)量m/z40～500，確定各化合物掃描離子和保留時間；選擇離子掃描模式（SIM），掃描離子及SIM分組根據(jù)全掃描結果確定。

其他質(zhì)譜參數(shù)：采用全氟三丁胺自動調(diào)諧后生成參數(shù)。

1.4 試驗設計

試驗步驟：稱取1.0 g粉碎空白曬青茶樣加入到20 mL的頂空瓶中，加入4 mL超純水和轉子，聚四氟乙烯密封。將頂空瓶放置于磁力攪拌器上80 ℃的水浴中，300 r·min-1平衡10 min，后插入裝有萃取頭的SPME手柄，推出纖維萃取頭在頂空瓶上部空間萃取60 min，收回萃取纖維頭，拔出SPME手柄插入氣相色譜進樣口，推出纖維萃取頭于一定溫度下（65 μm PDMS/DVB在270 ℃，85 μm PA在290 ℃）解吸附4 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)，每個萃取頭重復萃取3次。

在單因素試驗考察的基礎上，利用Minitable 17（Minitab Inc., USA）進行Plackett-Burman試驗設計，試驗分別對加鹽量、萃取溫度、萃取時間、溶液pH值、加水量和攪拌速率6個影響因素進行全面考察，選擇N=12的Plackett-Burman設計，根據(jù)單因素試驗的結果確定Plackett-Burman試驗的低水平（-1）值和高水平（1）值，以萃取目標化合物的峰面積為響應值。在HS-SPME分析中，pH值的改變往往可影響基質(zhì)溶液的性質(zhì)，進而改變目標分析物在樣品基質(zhì)和固定相之間的分配系數(shù)，同時提高待分析物的穩(wěn)定性，提高萃取頭對目標分析物質(zhì)的萃取效率和分析結果的準確性。試驗通過采用HCl和NaOH調(diào)節(jié)基質(zhì)溶液的pH值，考察pH值對萃取頭吸附目標農(nóng)藥檢測峰面積的影響。對于85 μm PA，pH值為4時萃取量達到最大，隨著pH值的進一步升高，萃取量有減小的趨勢；對于65 μm PDMS/DVB隨著pH值的增加，萃取量有增加的趨勢，但是對于85 μm PA和65 μm PDMS/DVB來說，改變pH值對萃取頭萃取影響都不是很明顯，因此在萃取過程中選擇直接加入超純水，不進一步調(diào)整溶液pH值。試驗設計如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗設計的因素和水平

2 結果與分析

2.1 響應面因素水平

根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選的結果，對影響85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取效率的重要影響因子采用Design-Expert 8. 0. 5b 軟件（State-Ease Inc., USA）進行Box-Behnken試驗設計（表2），進一步根據(jù)試驗的響應值（峰面積）進行數(shù)據(jù)分析，從而得到顯著影響85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取效率的各因子的最佳取值。采用方差分析、F檢驗和回歸顯著性分析對模型的擬合進行檢驗分析。同時采用方差分析和t檢驗對影響因子及其交互作用進行顯著性檢驗,刪除無統(tǒng)計學顯著意義的參數(shù)（P＞0.05），進而簡化預測模型。

表2 Box-Behnken實驗設計及水平

2.2 回歸方程及系數(shù)分析

根據(jù)表1因素和水平，分別采用Minitab軟件進行試驗設計（表3），同時根據(jù)設計程序下85 μm PA和65 μm PDMS/DVB檢測到農(nóng)藥殘留總峰面積進行數(shù)據(jù)回歸分析。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果

在試驗設計和檢測的基礎上，采用Mintab軟件對檢測結果進行分析，經(jīng)過回歸擬合，85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭各影響因素對檢測結果有顯著影響作用。PA影響因素回歸方程：

PDMS/DVB影響因素回歸方程：

通過對回歸模型進行方差分析，結果如表4所示，2個回歸模型均極顯著（85 μm PA:P=0.000；65 μm PDMS/DVB:P=0.001），失擬項均不顯著（85 μm PA:P=0.124；65 μm PDMS/DVB:P=0.517），同時也表明了未知因素對萃取結果的影響較小。85 μm PA和65 μm PDMS/DVB 2個萃取頭模型R2adj分別為93.44%和93.95%，表明了2個模型與試驗擬合度較好，可以采用模型對85 μm PA和65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取GC-MS檢測響應值進行預測分析。85 μm PA萃取頭模型中A、B、A2、B2、C2、D2對萃取檢測響應值影響極其顯著（P＜0.01），表明了萃取溫度、鹽添加量、萃取時間和加水量4個因素對萃取檢測響應值的影響不是單純的線性關系，其中還存在二次項對萃取檢測響應值的顯著影響，而兩兩因素之間AB、AC、AD、BC、BD、CD對萃取頭檢測響應值影響均不顯著（P值為0.067～0.942之間），說明模型中因素之間交互作用較??；65 μm PDMS/DVB萃取頭模型中，A、B、A2、B2、C2對萃取檢測響應值影響極顯著（P＜0.01），萃取溫度、鹽添加量和萃取時間3個因素對萃取檢測響應值同時存在線性和二次項的影響，兩兩因素之間AB、AC、BC對萃取頭檢測響應值影響均不顯著（P值為0.303～0.967之間），說明模型中因素之間交互作用較小。

表4 回歸模型方差分析

2.3 響應面分析及優(yōu)化

2.3.1 PA萃取頭影響因素響應面 在回歸模型分析的基礎上，利用Mintab軟件，將影響85 μm PA萃取的4個因素（萃取溫度、鹽濃度、萃取時間和加水量）中的其中2個因素固定在中心水平，繪制2個因素相應的曲面圖和等高線圖，結果如圖1—圖6所示。

試驗固定萃取時間和加水量不變，繪制響應曲面和等高線圖如圖1所示，隨著萃取溫度和鹽添加量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，可見萃取溫度和鹽添加量之間交互作用不明顯。

圖1 萃取溫度和鹽添加量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定鹽添加量和加水量不變，繪制響應曲面和等高線圖如圖2所示，隨著萃取溫度和萃取時間的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和萃取時間之間交互作用不明顯。

圖2 萃取溫度和萃取時間對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定鹽添加量和萃取時間不變，繪制響應曲面和等高線圖如圖3所示，隨著萃取溫度和加水量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和加水量之間交互作用不明顯。

圖3 萃取溫度和加水量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定萃取溫度和加水量，繪制響應曲面和等高線圖如圖4所示，隨著鹽添加量和萃取時間的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，鹽添加量對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，鹽添加量和萃取時間之間交互作用不明顯。

圖4 鹽添加量和萃取時間對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定萃取溫度和萃取時間，繪制響應曲面和等高線圖如圖5所示，隨著鹽添加量和加水量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，鹽添加量對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，鹽添加量和加水量之間交互作用不明顯。

圖5 鹽添加量和加水量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定萃取溫度和鹽添加量，繪制響應曲面和等高線圖如圖6所示，隨著萃取時間和加水量的增加，85 μm PA萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取時間對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取時間和加水量之間交互作用不明顯。

圖6 萃取時間和加水量對85 μm PA萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

2.3.2 PDMS/DVB萃取頭影響因素響應面 在回歸模型分析的基礎上，利用Mintab軟件，將影響65 μm PDMS/DVB萃取的3個因素中的其中1個因素固定在中心水平，繪制2個因素相應的曲面圖和等高線圖，結果如7至圖9所示。

試驗固定萃取時間，繪制響應曲面和等高線圖如圖7所示，隨著萃取溫度和鹽添加量的增加，65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和鹽添加量之間交互作用不明顯。

圖7 萃取溫度和鹽添加量對65 μm PDMS/DVB萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

試驗固定鹽添加量，繪制響應曲面和等高線圖如圖8所示，隨著萃取溫度和萃取時間的增加，65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，萃取溫度對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，萃取溫度和萃取時間之間交互作用不明顯。

試驗固定萃取溫度，繪制響應曲面和等高線圖如圖9所示，隨著鹽添加量和萃取時間的增加，65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取檢測峰面積均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從曲面變化的趨勢可知，鹽添加量對響應值的影響較大，通過等高線變化趨勢，鹽添加量和萃取時間之間交互作用不明顯。

圖9 萃取時間和鹽添加量對65 μm PDMS/DVB萃取檢測響應值影響的響應面（A）和等高線（B）圖

3 結 論

分別對2個回歸模型求解，得到85 μm PA萃取頭4個影響因素的最優(yōu)值分別為：萃取溫度95℃、鹽添加量1.65 g、萃取時間66 min、加水量 4 mL；65 μm PDMS/DVB萃取頭3個影響因素的最優(yōu)值分別為：萃取溫度64 ℃、鹽添加量1.19 g、萃取時間 62 min。結合單因素對其他因素的考察結果，在最優(yōu)條件確定的基礎上，響應面試驗進程3次萃取試驗驗證，結果顯示，優(yōu)化檢測方法可靠，可應用于萃取與檢測。