周 維，田丹丹，李朝生，覃柳燕，韋 弟，韋紹龍，劉挺燕，黃素梅

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/香蕉抗病種質(zhì)創(chuàng)制與病蟲害防控聯(lián)合實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】由尖孢鐮刀菌古巴?；?號小種(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace 4，F(xiàn)oc4)引起的香蕉枯萎病(Fusariumwilt)是目前世界上危害香蕉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的最嚴(yán)重病害[1]。已有研究表明，選育和種植抗病品種結(jié)合生物防治已成為防控香蕉枯萎病最切實可行的策略及方法之一[2-3]。桂蕉9號是廣西首個自主選育的抗枯萎病香蕉新品種[4]，但其抗性等級為中等，重病區(qū)種植還存在抗性不足等問題，利用該品種的內(nèi)生菌資源是開發(fā)其配套生物防控菌劑是目前解決該問題的重要途徑。內(nèi)生菌與宿主存在互利共生關(guān)系，產(chǎn)生的活性物質(zhì)能誘導(dǎo)或增強(qiáng)宿主植物對病蟲害及逆境脅迫的抗性[5-6]。因此，分離鑒定香蕉內(nèi)生細(xì)菌并進(jìn)行拮抗香蕉枯萎病菌活性評價，對利用香蕉內(nèi)生菌資源防控香蕉枯萎病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】張科立[7]、戴英葵等[8]從香蕉植株中分離到具有拮抗Foc4活性的內(nèi)生勞爾氏菌BEB3及BEB99，二者均能產(chǎn)生鐵載體并能提高香蕉植株的枯萎病防效。田丹丹等[9]、陳博等[10]、王宇光等[11]分別從香蕉植株中分離到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌、類芽孢桿菌和陰溝腸桿菌菌株均能促進(jìn)香蕉植株生長，降低枯萎病對蕉苗的危害。張建春等[12]研究顯示，內(nèi)生熒光假單孢菌UPMP3和伯克霍爾德菌UPMB3能誘導(dǎo)香蕉感病品種產(chǎn)生Foc4抗性。楊秀娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生枯草芽孢桿菌EBT1培養(yǎng)液活性物質(zhì)能顯著提高香蕉組培叢生芽的增殖率并提升植株SOD、PAL、POD和PPO等防御酶活性。桑建偉等[14]研究表明，內(nèi)生菌回接不同抗性香蕉品種，其定殖量及相對防效存在顯著差異。吳藹民等[15]研究了內(nèi)生菌73a在不同抗性品種棉花體內(nèi)的定殖和消長動態(tài)。馬鳳娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，接種生防菌XP1能提高香蕉根際土壤細(xì)菌物種豐富度和有益菌比例,有效防控大田香蕉枯萎病的發(fā)生?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】G9R-3菌株的菌體、發(fā)酵液及揮發(fā)性氣體均對香蕉枯萎病菌(Foc4)有較強(qiáng)抑制作用，但目前關(guān)于該菌株抑菌機(jī)制及防控枯萎病效果的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分離鑒定桂蕉9號植株根部內(nèi)生細(xì)菌G9R-3并分析其抑菌機(jī)制，回接不同品種香蕉并評價其防效，為開發(fā)利用該菌株配套抗病香蕉品種防控枯萎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株香蕉枯萎病病原菌Foc4、香蕉品種桂蕉1號和桂蕉9號香蕉組培盆栽苗均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供；紅研2號和萬鐘4號香蕉組培盆栽苗由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。供試培養(yǎng)基參考方中達(dá)[17]的方法使用LB和PDA培養(yǎng)基，菌株生理生化試驗所用試劑參考東秀珠和蔡妙英[18]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的試劑。儀器設(shè)備：BIOMETRAT professional PCR儀(德國耶拿)，UVI FireReader 凝膠成像儀(英國UVItec)。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌分離、篩選及鑒定 采用三步消毒法[18]分離健康香蕉植株根部內(nèi)生細(xì)菌，利用平板對峙法篩選其中具有拮抗香蕉枯萎病病原菌活性的菌株。菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性參考東秀珠和蔡妙英[18]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的方法 進(jìn)行分析。參考陳奕鵬[20]的方法進(jìn)行分子鑒定及16S rDNA 和gyrB基因序列PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌平板拮抗Foc4活性評價 配制PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌Foc4并制備菌餅，配制NA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌。將Foc4菌餅(D=5 mm)置于 PDA 培養(yǎng)基中央，在距離其兩側(cè)2.5 cm 處用接種環(huán)挑取供試內(nèi)生細(xì)菌單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，3 次重復(fù)，以不接種拮抗內(nèi)生細(xì)菌的Foc4生長情況為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用游標(biāo)卡尺測量拮抗帶寬度，計算平板菌落抑制率。菌落抑制率(%)=(對照生長直徑-處理拮抗帶直徑)/(對照生長直徑-菌餅直徑)×100。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對 Foc4菌落生長的影響 按照1.2.2的方法制備Foc4菌餅，LB搖瓶培養(yǎng)制備內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液，0.22 μm濾膜過濾菌體，以發(fā)酵液1∶1000接種到未凝固PDA培養(yǎng)基中混勻，待培養(yǎng)基凝固后制備帶毒平板。將Foc4菌餅(D=5 mm)置于帶毒平板中央，3次重復(fù)，以未加細(xì)菌發(fā)酵液的PDA平板為空白對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，十字交叉法測定Foc4菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-對照菌餅直徑)×100。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌揮發(fā)性氣體對Foc4菌落生長的影響 制備Foc4菌餅備用，采用平板對扣法[20]檢測內(nèi)生細(xì)菌揮發(fā)性氣體抑菌作用。在NA培養(yǎng)基平板表面涂布100 μl供試菌株孢子懸浮液，在PDA平板中央接種Foc4菌餅(D=5 mm)。NA平板在下，PDA平板在上，兩平板對扣后用封口膜封閉，3次重復(fù)，以空白NA平板為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，十字交叉法測定Foc4菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

1.2.5 內(nèi)生細(xì)菌回接不同香蕉品種盆栽苗防效評價 選取生長一致的4個香蕉品種(桂蕉1號、桂蕉9號、紅研2號和萬鐘4號)健康盆栽杯苗，采用常規(guī)水肥管理。參照桑建偉等[14]的方法，各取30株香蕉苗用灌根法接種內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液(濃度為1×106CFU/mL，100 mL/株)，每隔10 d接種1次，共接種3次，以不接種內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的植株為空白對照。最后一次接種內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液10 d后傷根接種107CFU/mL的Foc4孢子懸浮液，60 d后調(diào)查植株發(fā)病情況。參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T2248-2012)計算病情指數(shù)和進(jìn)行病害分級。

平均發(fā)病率(%)=各處理發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100

病情指數(shù)=[∑(各級病株數(shù)×該病級)]/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級) ×100

相對防效(%)=(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離、篩選和鑒定

從桂蕉9號植株根部分離得到一株內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對峙試驗篩選得到具有較強(qiáng)拮抗香蕉枯萎病菌Foc4活性的菌株G9R-3；菌株經(jīng)革蘭氏染色呈陽性，桿狀，產(chǎn)芽孢，在NA培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣不規(guī)則，表面光滑濕潤(圖1)，呈淡黃色。其生理生化特性檢測結(jié)果見表1。PCR擴(kuò)增菌株G9R-3的16S rDNA序列全長為1427 bp，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果與B.amyloliquefaciens、B.velezensis和B.subtilis序列相似度均在99 %以上(圖2)。選取相應(yīng)菌種模式菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，菌株G9R-3與B.velezensisSQR9、B.amyloliquefaciensFZB42聚在同一分支，親緣關(guān)系較近。為進(jìn)一步確認(rèn)其親緣關(guān)系，采用PCR擴(kuò)增菌株G9R-3gyrB基因序列與相應(yīng)菌種模式菌株序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果(圖3)表明，該菌株基因序列全長為1265 bp，與B.amyloliquefaciensFZB42相似度最高，達(dá)99 %，聚于同一分支，親緣關(guān)系更近。綜合以上序列比對結(jié)果，將菌株G9R-3鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 菌株G9R-3的平板菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain G9R-3

表1 菌株G9R-3生理生化特性

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖3 基于gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on gyrB gene sequence

2.2 菌株G9R-3平板的拮抗Foc4活性分析

從圖4可看出，以劃線法評價菌株G9R-3拮抗Foc4活性，7 d后檢測抑菌帶寬度為1.34 cm，對照Foc4菌落的直徑為6.84 cm，通過計算得到菌株G9R-3對Foc4菌落的抑制率為83.05 %。說明菌株G9R-3菌體在平板上具有較強(qiáng)的抑制Foc4菌落生長活性。

圖4 菌株G9R-3平板的拮抗Foc4效果Fig.4 Antagonistic effect against Foc4 of strain G9R-3 plate

2.3 菌株G9R-3發(fā)酵液的拮抗Foc4活性分析

從圖5可看出，以帶毒平板生長速率法評價菌株G9R-3發(fā)酵液拮抗Foc4活性，7 d后測量Foc4菌落在發(fā)酵液平板上的直徑為5.33 cm，對照Foc4菌落的直徑為9.24 cm，經(jīng)計算菌株G9R-3發(fā)酵液對Foc4菌絲生長的抑制率為42.35 %。說明菌株G9R-3發(fā)酵液中存在抑制Foc4菌絲生長的活性物質(zhì)。

圖5 菌株G9R-3發(fā)酵液對Foc4生長的抑制作用Fig.5 Growth inhibition of Foc4 by fermentation broth G9R-3

2.4 菌株G9R-3揮發(fā)性氣體的拮抗Foc4活性分析

平板對扣法評價結(jié)果(圖6)表明，菌株G9R-3揮發(fā)性氣體處理平板上Foc4菌落的直徑為3.75 cm，對照Foc4菌落的直徑為9.06 cm，經(jīng)計算揮發(fā)性氣體對Foc4菌絲生長的抑制率為58.64 %。說明菌株G9R-3產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體具有較強(qiáng)的抑制Foc4菌絲生長活性。

圖6 菌株G9R-3揮發(fā)性氣體對Foc4生長的抑制作用Fig.6 Growth inhibition of Foc4 by volatile gas G9R-3

2.5 G9R-3回接不同香蕉品種盆栽苗的相對防效

由表2可知，不同香蕉品種先接種G9R-3、再接種Foc4后，香蕉枯萎病發(fā)病率及病情指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，表明G9R-3能有效提升各香蕉品種對枯萎病的抗病性；各香蕉品種的相對防效排序為桂蕉1號>桂蕉9號>紅研2號>萬鐘4號，其中接種菌株G9R-3后感病品種桂蕉1號的發(fā)病率由對照的90.00 %降至36.67 %，病情指數(shù)由87.94降至30.78，相對防效達(dá)65.00 %；抗病品種中，G9R-3接種紅研2號的相對防效為29.91 %，接種萬鐘4號的相對防效為16.11 %，而接種桂蕉9號的效果最佳，發(fā)病率由33.33 %降至13.33 %，病情指數(shù)由23.57降至12.06，相對防效達(dá)48.83 %。

表2 內(nèi)生細(xì)菌G9R-3回接不同香蕉品種盆栽苗的抗病性表現(xiàn)

3 討 論

內(nèi)生菌具有在宿主體內(nèi)定殖的特性，能有效發(fā)揮其與宿主互利共生的作用，分離、利用香蕉內(nèi)生菌防控枯萎病是目前香蕉枯萎病研究的熱點(diǎn)之一[21-22]。

內(nèi)生菌的主要生防機(jī)制包括生態(tài)位競爭、活性物質(zhì)拮抗和誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)等[23-24]。柴慶凱等[25]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌LJ02能誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生β-1,3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶破壞病菌細(xì)胞壁，還能通過POD誘導(dǎo)植株產(chǎn)生木質(zhì)素和酚類物質(zhì)抵抗病害侵染，提高黃瓜對灰霉病菌的抗性。Deleu等[26]研究認(rèn)為內(nèi)生芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性素雖無直接抗真菌活性但能增強(qiáng)伊枯草菌素的抗真菌能力，能在植物根部表面形成生物膜，阻止病原菌入侵。劉端木等[27]從赤豆(Vignaangularis)中分離得到抑制赭曲霉和黃曲霉生長的拮抗細(xì)菌 SC-B15，能產(chǎn)生抑菌蛋白。在香蕉枯萎病防控方面，朱森林等[28]、田丹丹等[9]利用香蕉內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB33、GKT04回接香蕉，獲得良好的生防效果。桑建偉等[14]報道，香蕉內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17在不同抗性品種上的定殖量及防效存在差異，內(nèi)生菌更容易在感病品種上定殖，產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)能抑制枯萎病菌生長。周維等[29]研究發(fā)現(xiàn)，G9R-3發(fā)酵液產(chǎn)生的脂肽類化合物能破壞Foc4 細(xì)胞膜并引起菌絲腫大和畸形，并抑制其孢子萌發(fā)。本研究從抗病品種桂蕉9號植株根部分離得到一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌(菌株G9R-3)，通過接種不同抗枯萎病香蕉品種(抗性表現(xiàn)為桂蕉9號>萬鐘4號>紅研2號>桂蕉1號)，發(fā)現(xiàn)其能提高盆栽抗、感病香蕉品種的防治效果，其中與桂蕉1號和桂蕉9號的親和性更高，接種防效更佳，可能與菌株G9R-3在桂蕉1號和桂蕉9號中的定殖量較大有關(guān)。

內(nèi)生菌在植株體內(nèi)的有效定殖是提高枯萎病防效的關(guān)鍵[30]。吳藹民等[15]報道內(nèi)生菌更易于在感病品種中定殖，本研究還需進(jìn)一步探明菌株G9R-3在香蕉植株上的定殖規(guī)律。此外，本研究的菌株G9R-3分離自桂蕉9號，回接防效試驗結(jié)果較優(yōu)，因此，抗病香蕉品種的抗病性與菌株G9R-3種群的相關(guān)性也需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

從抗病品種桂蕉9號健康香蕉植株根部分離得到的一株內(nèi)生細(xì)菌G9R-3，鑒定為解淀粉芽孢桿菌，其菌體、發(fā)酵液及揮發(fā)性物質(zhì)均具有拮抗香蕉枯萎病菌Foc4的活性，能提高盆栽抗、感病香蕉品種的防治效果。