李洪軍，余云明，陽 興，周 文，李 明

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是一種常見的顱內(nèi)腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的45%，發(fā)病隱匿，生長速度快，因此常規(guī)的手術(shù)及放療等治療手段效果不甚理想，嚴重威脅人類生命健康[1]。腦膠質(zhì)瘤類型為浸潤性，主要為低分化的星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤和間變性星型細胞瘤3類，以膠質(zhì)母細胞瘤最為常見。膠質(zhì)瘤與正常腦組織界限不清，因此手術(shù)難以進行完全切除；另外，由于其對放化療并不敏感，因此常在治療后出現(xiàn)復發(fā)，不能對患者起到良好的治療作用，且伴隨的并發(fā)癥會加重患者痛苦，降低生存質(zhì)量[2]。異丙酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，近年來研究表明，異丙酚除了良好的麻醉效果外，還有較好的抑癌作用，可能抑制乳腺癌[3]、肝癌[4]等惡性腫瘤細胞的生長和侵襲。楊陳祎等[5]研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可能影響膠質(zhì)瘤細胞的生長和凋亡，但具體機制尚不清楚。本研究通過采用不同濃度的異丙酚處理膠質(zhì)瘤細胞U87，從而探討其對膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡情況的作用及機制，以期為異丙酚用于膠質(zhì)瘤治療提供實驗數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 膠質(zhì)瘤U87細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑與材料 異丙酚購自北京天根生化科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；結(jié)晶紫、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司；Annexin V細胞凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室及Matrigel購自美國BioRad公司，本研究所使用的抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 細胞解凍、復蘇后培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合率達到90%時進行傳代培養(yǎng)。參考Liu等[6]方法，異丙酚溶于培養(yǎng)基后，使其終濃度為0.01、0.02、0.05 mmol/L，將研究細胞分為空白對照組(BC組)、P1組(0.01 mmol/L)、P2組(0.02 mmol/L)、P3組(0.05 mmol/L)[7]。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖情況 將“1.2.1”項各組培養(yǎng)至對數(shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板(4×105個/孔)，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，加入CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀檢測吸光度值A(chǔ)(450 nm),細胞增殖率(%)=(研究組A值-空白對照組A值)/(對照孔A值-空白對照組A值)×100%。

1.2.3 平板細胞克隆形成實驗檢測膠質(zhì)瘤U87細胞增殖情況 收集“1.2.1”項中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的U87細胞，胰蛋白酶消化、重懸，梯度稀釋后接種至含RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中(1 000個/皿)，分散均勻后置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，待出現(xiàn)肉眼可見克隆后，棄去上清，PBS清洗，4%多聚甲多醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，20 min后，洗去染色液，空氣干燥。計算4組細胞克隆形成率?？寺⌒纬陕?(形成克隆數(shù)目/接種細胞數(shù)目)×100%。

1.2.4 細胞凋亡情況檢測 收集“1.2.1”項細胞，胰蛋白酶消化，接種于96孔板(5.0×104個/孔)培養(yǎng)，48 h后收集細胞，洗滌細胞，4 ℃離心后重懸，加入PI及Annexin-V-FITC混合均勻，37 ℃反應(yīng)20 min，加入緩沖液，檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移情況 將“1.2.1”項下培養(yǎng)至對數(shù)生長期細胞接種至96孔培養(yǎng)板(4×105個/孔)，待細胞長滿底部，利用滅菌槍頭在玻片底部培養(yǎng)基劃痕，PBS沖洗劃下的細胞，利用含有不同濃度異丙酚的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，記錄0 h、48 h細胞劃痕寬度。倒置顯微鏡觀察細胞遷移率=(研究組劃痕縮小寬度/對照組劃痕縮小寬度)×100%。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲情況 待“1.2.1”項中各組細胞消化離心，PBS清洗后重懸，將其以1×105/ml的密度接種于Transwell小室上層，利用含有不同濃度異丙酚的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，Transwell小室上層加入基質(zhì)膠Matrigel，下室預先加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，無水甲醇固定10 min。結(jié)晶紫染色，隨機取6個視野顯微鏡下拍照(400×)，計數(shù)發(fā)生侵襲的細胞數(shù)量。

1.2.7 Western blot法檢測相關(guān)蛋白 收集“1.2.1”項中各組細胞，提取總蛋白，利用Western blot法檢測Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase，MMP)9、Caspase-9、3-磷酸肌醇激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、磷酸化-PI3K(p-PI3K)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Protein-serine-threonine kinase，AKT)、磷酸化-AKT(p-AKT)相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 U87細胞增殖檢測結(jié)果 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細胞增殖率低于BC組(P<0.05)。隨著異丙酚濃度升高，U87細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.2 平板克隆檢測結(jié)果 P1、P2、P3組U87細胞平板克隆形成率低于對照組(P<0.05)，P3組顯著低于 P1和P2組(P<0.05)。見圖2。

圖1 細胞增殖檢測結(jié)果

圖2 平板克隆檢測結(jié)果

2.3 U87細胞凋亡檢測結(jié)果 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細胞凋亡率較對照組顯著升高(P<0.05)，隨著異丙酚濃度升高，U87細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖3。

2.4 U87細胞遷移、侵襲檢測結(jié)果 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細胞遷移率、侵襲細胞數(shù)降低(P<0.05)，隨著異丙酚濃度升高，U87細胞遷移率、侵襲細胞數(shù)降低(P<0.05)。見圖4、圖5。

2.5 增殖、凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達情況 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組細胞Ki67、MMP-9蛋白表達量降低(P<0.05)，且隨異丙酚濃度升高，表達量逐漸降低(P<0.05)；Caspase-9蛋白表達量升高(P<0.05)，隨異丙酚濃度升高，表達量逐漸升高(P<0.05)。見圖6。

圖3 細胞凋亡檢測結(jié)果

圖4 異丙酚處理后各組U87細胞遷移檢測結(jié)果

2.6 PI3K/ATK信號通路相關(guān)蛋白表達情況 不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組細胞p-PI3K、p-ATK蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，且隨異丙酚濃度升高，p-PI3K、p-ATK蛋白表達量逐漸降低(P<0.05)；PI3K、ATK蛋白表達量無顯著變化(P>0.05)。見圖7。

圖5 異丙酚處理后各組U87細胞侵襲檢測結(jié)果

圖6 Western blot檢測增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達

3 討論

目前，膠質(zhì)瘤常用的治療方式為手術(shù)切除，但術(shù)后患者復發(fā)率較高，且術(shù)后并發(fā)癥極大地增加了患者的痛苦。因此，在圍手術(shù)期減輕患者痛苦的基礎(chǔ)上，有效控制膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)移和術(shù)后病情復發(fā)已成為當前研究熱點。

麻醉藥可在腫瘤切除手術(shù)中緩解疼痛，抑制機體應(yīng)激反應(yīng)，進而激活神經(jīng)內(nèi)分泌，抑制自然殺傷細胞，但同時也具有抑制免疫功能的作用，因此，近年來，人們開始注意到麻醉藥對腫瘤細胞的作用。異丙酚是腫瘤患者術(shù)中常用的靜脈麻醉藥之一，因其用藥量少，麻醉時間長等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚具有明顯的抗癌作用，可通過調(diào)控多種信號傳導途徑及miRNA，進而抑制腫瘤細胞增殖及侵襲[9-10]。Zhang等[11-12]研究結(jié)果表明，1～5 μg/ml的異丙酚可抑制宮頸癌HeLa細胞、骨肉瘤HOS細胞系的侵襲能力。在不同腫瘤中，異丙酚可通過不同作用機制發(fā)揮作用。有報道顯示，異丙酚可通過間接抑制整合素聚集及激動蛋白應(yīng)力纖維形成而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[11]。另有研究表明，異丙酚可顯著提高肝癌細胞HepG2中miR-199a表達，從而抑制肝癌細胞侵襲[12]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細胞增殖率較BC組均顯著降低，隨著異丙酚濃度升高，U87細胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高，侵襲及遷移能力降低，提示異丙酚可能具有抑癌作用，與Cui等[13]研究結(jié)果一致。

圖7 Western blot檢測PI3K/ATK信號通路相關(guān)蛋白表達

腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在正常生理狀態(tài)下，細胞增殖與凋亡處于動態(tài)平衡，在癌癥中，該平衡被打破。而細胞侵襲是癌癥發(fā)生發(fā)展的前提，與腫瘤侵犯周圍組織有關(guān)。PI3K/AKT通路與癌細胞的增殖、凋亡及侵襲有關(guān)，PI3K作為原癌基因可激活磷脂酰肌醇及肌醇，可激活下游的Akt，使其磷酸化為p-Akt，進而激活或抑制下游基因表達，參與癌細胞的增殖、凋亡及侵襲[14-16]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細胞中p-PI3K、p-ATK蛋白低表達，PI3K、AKT蛋白無顯著差異，且呈濃度依賴性，提示異丙酚可能抑制膠質(zhì)瘤U87細胞中PI3K/AKT通路激活。研究表明，p-AKT可磷酸化Caspase-9基因196位絲氨酸位點，抑制其促凋亡作用[17]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，可降解細胞外基質(zhì)，破壞基底膜的完整性，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。王佳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9可能參與膠質(zhì)瘤細胞侵襲，與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。而PI3K/AKT通路可能通過影響MMP-9蛋白表達參與調(diào)控腫瘤細胞侵襲。Ki67與細胞增殖密切相關(guān)，是常見的腫瘤增殖標志物，與膠質(zhì)瘤細胞異常增殖有關(guān)[19]。本研究結(jié)果表明，不同濃度異丙酚處理后，P1、P2、P3組膠質(zhì)瘤U87細胞中Ki67、MMP-9蛋白表達量降低，Caspase-9蛋白高表達，提示異丙酚可能通過抑制PI3K/AKT通路激活，進而抑制膠質(zhì)瘤U87細胞增殖，促進凋亡，抑制細胞侵襲能力。

綜上所述，異丙酚可能通過抑制膠質(zhì)瘤U87細胞PI3K/AKT通路激活，進而抑制細胞增殖，促進凋亡，抑制細胞侵襲、遷移能力。