賈茹珺，李鐵剛

0 引言

近年來(lái)，百草枯(Paraquat，PQ)中毒的死亡率居高不下。百草枯可在多種器官內(nèi)分布，具有明顯的肺毒性，其引起的不可逆的肺纖維化是PQ中毒的主要死因[1]。上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指在一定的病理生理?xiàng)l件下上皮細(xì)胞表型發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程[2]。在此過(guò)程中，細(xì)胞上皮標(biāo)志物如E-cadherin、緊密連接蛋白-1、細(xì)胞角蛋白表達(dá)下降[3]，而表達(dá)間質(zhì)的標(biāo)志物如α-SMA、波形蛋白(Vimentin)、N-鈣黏附蛋白(N-cadherin)等表達(dá)上升[4-6]。EMT可參與肺間質(zhì)纖維化的過(guò)程，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可通過(guò)EMT獲得成纖維細(xì)胞樣表型，促進(jìn)膠原沉積及肺纖維化的發(fā)生，有研究證實(shí)，EMT參與百草枯中毒所致的肺間質(zhì)纖維化的過(guò)程[7-8]。

細(xì)胞發(fā)生EMT后，其分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)的能力會(huì)增強(qiáng)[9]，MMP是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)降解破壞的重要蛋白水解酶，ECM合成和降解失衡會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)積聚，是導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的重要病理生理因素，MMP家族的重要成員包括MMP2和MMP9，目前關(guān)于MMP2在肺纖維化中的作用研究主要集中于二氧化硅和博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中[10-12]。有關(guān)MMP2在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化中的研究極少。在PQ誘導(dǎo)的肺損傷中，MMP9主要參與PQ誘導(dǎo)的急性肺損傷的早期炎癥階段，而MMP2可能主要參與晚期的肺組織損傷修復(fù)和纖維化過(guò)程[13]，深入研究MMP2在PQ中毒所致的肺EMT過(guò)程中的作用具有重要的意義。

近年來(lái)，基因芯片和高通量測(cè)序等技術(shù)的飛速發(fā)展徹底改變了研究者對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的認(rèn)識(shí)，除了編碼蛋白的mRNA，細(xì)胞內(nèi)還存在大量不能編碼蛋白的RNA即非編碼RNA(Non-protein-coding RNA，ncRNA)。ncRNA分為管家性和具有調(diào)控功能的RNA，其中調(diào)控型ncRNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)等，miRNA和LncRNA在機(jī)體中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，它們可通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯來(lái)影響生物反應(yīng)[14]。

miRNA是長(zhǎng)度為22～28 nt的單鏈RNA，由一段具有發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)的miRNA前體依次經(jīng)2個(gè)核糖核酸酶Ⅲ內(nèi)切酶(RNase Ⅲ endonucleases)(Drosha和Dicer)作用后形成，在進(jìn)化方面具有保守性，其表達(dá)具有組織特異性和階段特異性，是影響不同細(xì)胞的生理及病理機(jī)制的重要元件，可影響靶基因的穩(wěn)定性并抑制靶基因蛋白水平的表達(dá)。在人類(lèi)基因組中約有1 000個(gè)miRNA被鑒定出來(lái)，其中約有30%的基因都受其調(diào)控[15]。成熟的miRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，再特異性地與靶RNA結(jié)合致其降解。miR-17～92 家族包括7種亞型：miR-17-5p、miR-17-3p、miR-20a、miR-19a、miR-19b、miR-92a和miR-18a。miR-17-5p在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的肺組織和成纖維細(xì)胞中低表達(dá)[16]。miR-17-5p可以調(diào)控MMP2[17],且經(jīng)TargetscanHuman 7.2網(wǎng)站(www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)miR-17-5p和MMP2之間存在結(jié)合位點(diǎn)。目前對(duì)miR-17-5p在PQ中毒中的作用僅僅局限于神經(jīng)毒性的研究，尚無(wú)人探討其在PQ致肺EMT中的作用，且MMP2和miR-17-5p在PQ致肺EMT中的作用仍然未知，本研究就此進(jìn)行分析，為PQ所致肺EMT提供新的潛在診治靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人類(lèi)肺腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清(Foetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI 1640 (SH30809.01，Hyclone)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃，5%CO2。

1.2 百草枯染毒 二氯百草枯購(gòu)買(mǎi)于Sigma-Aldrich (36541，USA)。設(shè)置一定范圍的PQ染毒暴露濃度梯度，用無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基溶解PQ粉末，配制成高濃度PQ儲(chǔ)備溶液備用。最終加入培養(yǎng)皿中的PQ終濃度依次稀釋為15、30、60 μmol/L，培養(yǎng)6 d，2 d換液1次。

1.3 Western blot 用RIPA中性裂解液(P0013C，江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解A549細(xì)胞并提取蛋白。經(jīng)BCA法(北京康為世紀(jì)公司)蛋白定量后，取30 μg的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，恒流轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后孵育一抗[抗GAPDH抗體(10494-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，抗E-cadherin抗體(ab76055)、抗α-SMA抗體(ab32575)、抗MMP2(ab37150)抗體購(gòu)自Abcam公司]4 ℃過(guò)夜，孵育相應(yīng)的羊抗鼠(ab97040)或羊抗兔(ab7085)二抗1 h。孵育結(jié)束后顯色成像，并用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1.4 qRT-PCR 用RNAisoplus (TAKARA，Japan)提取細(xì)胞總RNA，取500 ng的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(TAKARA，Japan)，miR-17-5p及U6在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)使用廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供的特異性RT Primer。

反轉(zhuǎn)錄完成后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，miR-17-5p及U6擴(kuò)增引物購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，其余引物由上海生工生物股份有限公司合成。見(jiàn)表1。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-17-5p的mimic及inhibitor購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞均勻接種于60 mm培養(yǎng)皿中，穩(wěn)定24 h左右，使細(xì)胞量達(dá)到50%左右；參照銳博生物miRNA產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)稀釋mimic或inhibitor及其各自的陰性對(duì)照，并制備轉(zhuǎn)染混合液；將混合液加入到完全無(wú)雙抗培養(yǎng)基中并進(jìn)行加藥處理，37 ℃培養(yǎng)96 h收集細(xì)胞檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PQ染毒后E-cadherin、α-SMA及MMP2蛋白表達(dá)情況 選取15、30、60 μmol/L 3個(gè)濃度PQ溶液對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行染毒，培養(yǎng)6 d后，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)從蛋白水平檢測(cè)染毒細(xì)胞E-cadherin、α-SMA及MMP2表達(dá)的變化情況。

結(jié)果顯示，15 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.759,P=0.153);30 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達(dá)下調(diào)(t=3.871，P=0.018)，60 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達(dá)下調(diào)更明顯(t=4.783，P=0.009)。15 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.235,P=0.820);30 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達(dá)上調(diào)(t=2.504，P=0.037)，60 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達(dá)上調(diào)更明顯(t=3.474，P=0.008)15 μmol/L PQ染毒組MMP2表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.088,P=0.338);30 μmol/L PQ染毒組的MMP2表達(dá)上調(diào)(t=3.977，P=0.016)，60 μmol/L PQ染毒組MMP2表達(dá)上調(diào)更明顯(t=5.165，P=0.007)。見(jiàn)圖1。

2.2 PQ染毒后E-cadherin、α-SMA、MMP2 mRNA表達(dá)情況 細(xì)胞完成染毒后，提取RNA從mRNA水平驗(yàn)證EMT相關(guān)基因及MMP2的表達(dá)情況，qRT-PCR結(jié)果與Western blot一致。PQ染毒組與對(duì)照組相比，15 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達(dá)無(wú)顯著改變(t=0.620,P=0.569),30 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達(dá)下調(diào)(t=4.679，P=0.010)，60 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達(dá)下調(diào)更明顯(t=97.520，P<0.001)；15 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達(dá)無(wú)顯著改變(t=1.148,P=0.315)，30 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達(dá)上調(diào)(t=6.481，P=0.003)，60 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達(dá)上調(diào)更明顯(t=24.53，P<0.001)；15 μmol/L PQ染毒組MMP2表達(dá)無(wú)顯著改變(t=2.659,P=0.057)，30 μmol/L PQ染毒組MMP2表達(dá)上調(diào)(t=6.004，P=0.004)，60 μmol/L PQ染毒組MMP2表達(dá)上調(diào)更明顯(t=7.198，P=0.002)。見(jiàn)圖2。

表1 qRT-PCR引物序列

圖1 Western blot檢測(cè)PQ染毒后E-cadherin、α-SMA、MMP2表達(dá)

2.3 miR-17-5p和MMP2之間結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) TargetscanHuman 7.2網(wǎng)站(www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)miR-17-5p和MMP2的3’端非翻譯區(qū)(3-untranslated region，3’UTR)存在兩處結(jié)合位點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.4 miR-17-5p在PQ致細(xì)胞EMT模型中的表達(dá)情況及其對(duì)MMP2的影響 從RNA水平檢測(cè)PQ染毒后miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量的變化，與對(duì)照組相比，15 μmol/L PQ染毒組miR-17-5p表達(dá)無(wú)顯著改變(t=0.211,P=0.843)，30 μmol/L PQ染毒組miR-17-5p表達(dá)下調(diào)(t=4.568，P=0.010)，60 μmol/L PQ染毒組miR-17-5p表達(dá)下調(diào)更明顯(t=8.325，P=0.001)，說(shuō)明miR-17-5p在PQ中毒所致EMT的細(xì)胞模型中低表達(dá)(圖4A)。進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17-5p與MMP2之間的關(guān)系，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-17-5p的mimic(化學(xué)合成的成熟miRNA雙鏈)和inhibitor(化學(xué)修飾的成熟miRNA互補(bǔ)單鏈)來(lái)上調(diào)或下調(diào)miR-17-5p的表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證mimic和inhibitor的效能及其對(duì)MMP2表達(dá)的影響，轉(zhuǎn)染mimic后細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)明顯上調(diào)(t=21.510，P<0.001)，MMP2表達(dá)下調(diào)(t=7.458，P=0.002)(圖4B)；轉(zhuǎn)染inhibitor后細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)下調(diào)(t=2.856，P=0.046)，MMP2表達(dá)上調(diào)(t=5.746，P=0.005)(圖4C)。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)PQ染毒后E-cadherin、α-SMA、MMP2 mRNA表達(dá)

圖4 miR-17-5p在PQ致細(xì)胞EMT模型中的表達(dá)情況及作用

3 討論

PQ是目前世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑，其毒性強(qiáng)、中毒劑量小、預(yù)后極差。目前尚無(wú)針對(duì)PQ的特效解毒藥，PQ中毒機(jī)制的研究具有重要的臨床意義。PQ具有明顯的肺毒性，在任何暴露途徑下都主要積聚于肺泡上皮細(xì)胞，PQ在肺內(nèi)的聚積呈時(shí)間依賴(lài)性增加，會(huì)破壞肺組織、引起過(guò)度修復(fù)及間質(zhì)組織異常沉積，其導(dǎo)致的不可逆的和廣泛的肺纖維化是PQ中毒的主要死因[18]。EMT常見(jiàn)于腫瘤和纖維化過(guò)程，在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞會(huì)下調(diào)E-cadherin在內(nèi)的細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使細(xì)胞之間的連接作用減弱甚至消失，而間質(zhì)表達(dá)標(biāo)志物會(huì)上調(diào)，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力[19-20]，EMT也可參與肺間質(zhì)纖維化的過(guò)程[21]，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可通過(guò)EMT獲得成纖維細(xì)胞樣表型，促進(jìn)膠原沉積及肺纖維化的發(fā)生[22-23]。深入探討EMT在PQ所致肺EMT中的作用機(jī)制具有重要臨床意義。

PQ中毒后，肺上皮細(xì)胞的EMT可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[23-24]，首先，本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PQ中毒后細(xì)胞的EMT過(guò)程，發(fā)現(xiàn)PQ中毒可以引起A549細(xì)胞的EMT改變，Western blot和qRT-PCR結(jié)果一致提示：一定適宜濃度的PQ染毒后，A549細(xì)胞會(huì)下調(diào)上皮表達(dá)標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，而上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，驗(yàn)證了PQ的促EMT作用。

明膠酶MMP2是一種與遷移能力密切相關(guān)的蛋白水解酶，可降解基膜的層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白，破壞其完整性。同時(shí)這種破壞會(huì)進(jìn)一步加重組織損傷修復(fù)，使肺纖維化進(jìn)行性加重惡化[25]。除了降解基質(zhì)成分外，MMP2可以調(diào)節(jié)趨化因子和細(xì)胞因子，在炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程中可促進(jìn)遷移到炎癥部位，是和細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)有關(guān)的重要分子[26]。已有研究表明，MMP2的表達(dá)異常與肺纖維化密切相關(guān)[27]。在肺纖維化的發(fā)展過(guò)程中，MMP2的異常調(diào)節(jié)影響疾病的病理過(guò)程，MMP2可特異性地裂解ECM的重要成分，如明膠和膠原蛋白，從而破壞肺泡壁的結(jié)構(gòu)[10]。在慢性損傷過(guò)程中，MMP可能會(huì)破壞肺泡細(xì)胞外基質(zhì)支架，以致破壞正常修復(fù)所需的結(jié)構(gòu)模板[28-29]。本研究顯示，在PQ致A549細(xì)胞EMT模型中，MMP2表達(dá)上調(diào)。MMP2在PQ致肺EMT中的作用有待進(jìn)一步研究。

miRNA是一種具有調(diào)節(jié)功能的短鏈ncRNA，在動(dòng)物細(xì)胞中大多數(shù)的miRNA與其靶基因并不完全互補(bǔ)，miRNA的種子區(qū)序列(Seed region)通過(guò)和靶基因的3’UTR部分互補(bǔ)，進(jìn)而阻止其轉(zhuǎn)錄后的翻譯，起到下調(diào)和抑制基因表達(dá)的作用[30]。miRNA在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用[31-33]。miR-17-5p是miR-17～92 家族的成員，在IPF患者肺組織和成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可以作用于DNA甲基化相關(guān)的分子，在IPF肺成纖維細(xì)胞中上調(diào)miR-17～92 的表達(dá)，可以下調(diào)纖維化基因的表達(dá)，并使細(xì)胞表型正?；痆16]。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)PQ致A549細(xì)胞EMT模型中miR-17-5p的表達(dá)情況，研究表明，miR-17-5p在該模型中表達(dá)下調(diào)。TargetscanHuman 7.2網(wǎng)站(www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)miR-17-5p和MMP2存在結(jié)合位點(diǎn)，因此，我們進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-17-5p的mimic和inhibitor上調(diào)或下調(diào)miR-17-5p來(lái)研究其對(duì)MMP2的影響。本研究證實(shí)，增加miR-17-5p的表達(dá)量可使MMP2的表達(dá)下調(diào)，相反，降低miR-17-5p的表達(dá)量可使MMP2的表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果驗(yàn)證了MMP2是miR-17-5p的下游靶基因，它的表達(dá)受到miR-17-5p的抑制。

綜上所述，在PQ致肺上皮細(xì)胞EMT模型中，MMP2的表達(dá)升高，miR-17-5p表達(dá)下調(diào)，miR-17-5p和MMP2之間存在結(jié)合位點(diǎn)，MMP2的表達(dá)受miR-17-5p調(diào)控，使其表達(dá)受到抑制。本研究初步揭示了PQ致肺上皮細(xì)胞EMT中的miR-17-5p和 MMP2之間的相互作用，為PQ致肺EMT的診斷和治療提供新的理論依據(jù)，但仍需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)和應(yīng)用。