岳蘇陽，丁 欽，李慧華，陳 銳*

0 引言

氟化物廣泛存在于自然界和日常生活中，目前正成為一種不可避免的環(huán)境污染物，其能夠引起海馬神經(jīng)元損傷、影響神經(jīng)再生以及突觸可塑性。有研究表明，氟化物的細胞毒性與細胞凋亡、氧化應(yīng)激、DNA和RNA的一般變化以及蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)[1]。長期暴露會導(dǎo)致氟中毒和不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷，并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，損害神經(jīng)發(fā)生、突觸的可塑性以及突觸的功能，破壞突觸相關(guān)蛋白的表達，導(dǎo)致大腦皮層微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、突觸素(SYP)和發(fā)育受調(diào)節(jié)的腦蛋白(Dbn)在蛋白和mRNA水平上的表達明顯降低，氟化物介導(dǎo)的認知功能障礙的減少可能是由于這些突觸相關(guān)蛋白表達的破壞，導(dǎo)致神經(jīng)元功能減弱而引起[2-3]。有研究表明，Wnt信號通路參與了暴露于氟化物的PC-12細胞的抗增殖過程，DDK1則能夠減弱PC-12細胞中氟化物的抗增殖活性[4]。此外，氟化物可通過JNK和Wnt信號通路來抑制細胞增殖。

Dickkopf-1 (DKK-1)在體內(nèi)參與了許多病理生理過程，其異常表達不僅會改變典型Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)蛋白和基因的表達，還會改變其他信號通路中相關(guān)蛋白和基因的表達。以往對DKK-1的研究主要集中在其在腫瘤中的作用，近年大量研究表明，其在胚胎發(fā)育、神經(jīng)再生、突觸形成等方面發(fā)揮著重要作用，因此，DKK-1在神經(jīng)發(fā)育不良、認知功能障礙、情緒障礙等神經(jīng)精神疾病中的作用越來越受到人們的重視[5]。DKK-1作為調(diào)控Wnt通路的關(guān)鍵負性因子，在正常腦組織中很少表達，但是DKK-1在發(fā)生神經(jīng)元凋亡的腦組織中高表達，提示DKK-1可能參與了神經(jīng)元凋亡的過程[6]。DKK-1在許多腫瘤中低表達，但在部分腫瘤中高表達，越來越多的證據(jù)表明，DKK-1在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著復(fù)雜而不同的作用[7]。因此，筆者提出設(shè)想，DKK-1可通過誘導(dǎo)氟中毒神經(jīng)細胞的凋亡，抑制神經(jīng)再生，從而改變認知功能。本實驗通過對PC12細胞給予氟化鈉處理，觀察PC12細胞的增殖、凋亡情況以及DKK-1、β-catenin的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞株購自上海中科院細胞所，NaF購自德國耶拿生物科學(xué)公司，RPMI-1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gemini公司，蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自徐州博立達生物科技有限公司，CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所，DKK-1、β-catenin兔單克隆抗體購自美國Abcam公司，actin鼠單克隆抗體購自美國Santa公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng) 用含10%FBS、雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基作為生長培養(yǎng)基，將PC12細胞接種到半徑5 cm的培養(yǎng)皿中，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃。待細胞生長密度達70%～80%后，用胰蛋白酶EDTA消化液加以消化細胞，按1∶3予以分皿傳代。

1.2.2 CCK-8檢測相關(guān)細胞增殖率 細胞以5×103/孔密度接種到96孔板中，待細胞貼壁后加入2 000 μM NaF，干預(yù)0、6、12、24、48 h。每組設(shè)置了6個副孔。吸除培養(yǎng)基，用37 ℃ PBS洗2次，每孔加入100 μl用培養(yǎng)基配制的10%CCK-8液體，在37 ℃、5%CO2條件下培育1 h，并使用450 nm波長酶標儀測定吸光度值。

1.2.3 Western blot方法檢測DKK-1與β-catenin蛋白表達水平 按照“1.2.2”所示分組，2 000 μM NaF干預(yù)，按照試劑盒說明書步驟予以提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，牛奶室溫封閉2 h，1抗4 ℃孵育過夜，Washing buffer清洗5 min×3次，熒光2抗室溫孵育2 h，Washing buffer清洗5 min×3次，Odyssey紅外激光成像，Image J軟件分析灰度值。

1.2.4 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶處理處于對數(shù)生長期的PC12細胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度約5×106個細胞/15 ml，重新接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h待細胞密度達70%～80%時即可用于轉(zhuǎn)染；向滅菌離心管中加入無雙抗培養(yǎng)基與病毒液(10 μl n-siRNA、10 μl Dkk1-siRNA)，調(diào)整總體積為6 ml，混勻后，給細胞換液，于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，加入2 ml PBS液清洗2次，輕柔晃動培養(yǎng)皿以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物后倒棄；然后緩慢加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基6 ml，于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，若效果較好，則予以提取細胞蛋白，Western blot檢測DKK-1干擾效果。轉(zhuǎn)染成功后加入NaF藥物干預(yù)，檢測Wnt/β-catenin通路蛋白變化。依據(jù)說明書，運用Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 NaF對PC12細胞活性的影響 光鏡下觀察，對照組細胞貼壁良好，細胞呈梭形，向外突起明顯。細胞經(jīng)NaF損傷后，細胞皺縮，突起變短，部分細胞甚至脫落。CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，氟化鈉藥物組細胞活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

圖1 NaF對PC12細胞活性的影響

*P<0.05,**P<0.01

2.2 NaF對DKK-1蛋白表達的影響 Western blot方法檢測NaF對DKK-1蛋白表達的影響，與對照組比較，NaF損傷24 h和48 h后，DKK-1蛋白的表達隨著NaF損傷時間的增加而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot方法檢測NaF損傷后細胞中DKK-1蛋白表達

2.3 轉(zhuǎn)染 熒光顯微鏡下觀察空載病毒(n-siRNA)與DKK-1干擾病毒(DKK-1-siRNA)轉(zhuǎn)染情況，WB方法結(jié)果提示DKK-1干擾效果較好(圖3)。

圖3 DKK-1-siRNA與n-siRNA干擾結(jié)果對比

2.4 DKK-1對Wnt/β-catenin信號通路的影響 與n-siRNA對比，NaF組DKK-1蛋白表達明顯升高，β-catenin蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與n-siRNA+NaF組對比，DKK-1-siRNA組DKK-1蛋白表達降低，β-catenin蛋白表達升高(P<0.05)。見圖4。

2.5 DKK-1對細胞凋亡的影響 與n-siRNA對比，n-siRNA+NaF組細胞凋亡增多。與n-siRNA+NaF組對比，DKK-1-siRNA組細胞凋亡減少。見圖5。

3 討論

流行病學(xué)研究報告顯示，高氟化飲用水可能會顯著降低接觸兒童的智商(IQ)。有報道，突觸可塑性是發(fā)展兒童的學(xué)習(xí)和記憶技能的基礎(chǔ)[8]。氟化物暴露與智商的關(guān)系呈分段線性關(guān)系，具有閾值和飽和效應(yīng)，而適度過量氟化物暴露主要與優(yōu)秀智力的喪失有關(guān)[9]。

過量氟化物暴露導(dǎo)致的細胞凋亡、智力受損主要有以下機制：①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷：一定劑量的NaF可以導(dǎo)致神經(jīng)元細胞凋亡，其中過量的氟產(chǎn)生了過量的ROS，誘導(dǎo)神經(jīng)元中過度的氧化應(yīng)激和ERS，加劇了神經(jīng)元的凋亡，并且在細胞凋亡水平與細胞內(nèi)ROS水平之間呈線性關(guān)系，最后導(dǎo)致?lián)p傷[10]。②JNK途徑：高劑量的NaF通過半胱天冬酶介導(dǎo)但不依賴ROS的途徑中的細胞凋亡導(dǎo)致hESC死亡，并伴隨著磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)水平的增加。用p-JNK特異性抑制劑(SP600125)進行預(yù)處理可以以濃度和時間依賴性方式有效保護hESC免受NaF誘導(dǎo)的細胞死亡[11]。③Fas-L途徑：在一定的研究條件下，F(xiàn)as-L依賴性信號通路被激活，進而使得NaF誘導(dǎo)了低水平的細胞凋亡[12]。④Wnt/β-catenin 信號通路：氟能夠通過激活Wnt/β-catenin 途徑，并改變相關(guān)基因的表達和細胞中β-catenin蛋白的位置，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖[13]。⑤M1和M3毒蕈堿型乙酰膽堿受體的表達水平：慢性氟中毒大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙的機制可能與mAChRs中M1和M3表達的降低有關(guān)[14]。⑥氟化物對某些神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變及其神經(jīng)毒性：氟化物含量的增加導(dǎo)致某些神經(jīng)遞質(zhì)(如腎上腺素、組胺、5-羥色胺和谷氨酸鹽)的水平升高，而去甲腎上腺素、乙酰膽堿和多巴胺的水平呈劑量依賴性降低。同時，脂質(zhì)過氧化作用顯著增加，抗氧化防御系統(tǒng)受損。研究結(jié)果表明高劑量的NaF對神經(jīng)有毒性作用[15]。考慮到氟化物可通過JNK和Wnt信號通路來抑制細胞增殖，隨著 Wnt信號通路的活化，氟暴露水平的增加，GSK3β、β-catenin含量以及DKK-1、GSK3β、β-catenin 的異常檢出率逐漸增加，但 DKK-1 含量顯著降低[16-17]。DKK-1作為調(diào)控Wnt通路的關(guān)鍵負性因子，在正常腦組織中很少表達，但其在發(fā)生神經(jīng)元凋亡的腦組織中高表達，提示DKK-1可能參與了神經(jīng)元凋亡的過程[8]。

圖4 DKK-1對Wnt/β-catenin信號通路的影響

圖5 DKK-1對細胞凋亡的影響

Dickkopf(DKK)家族由脊椎動物中的4個分泌蛋白組成(DKK 1、2、3、4)，是Wnt信號通路最關(guān)鍵的拮抗劑家族之一，其中DKK-1主要通過與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/LRP6)受體及Kremen-1/2結(jié)合成復(fù)合物而阻斷Wnt信號傳導(dǎo)[18-19]。DKK-1是信號通路Wnt/β-catenin通路的抑制劑，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著相互矛盾的作用，既可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的癌基因啟動子，也可以作為腫瘤抑制子，DKK-1可以通過重塑腫瘤微環(huán)境和誘導(dǎo)炎癥，促進腫瘤的侵襲和遷移[20]。

Wnt信號傳導(dǎo)異常與幾種疾病有關(guān)，例如AD、癲癇、代謝性疾病等。其中阿爾茨海默氏病(AD)是老年性癡呆的最常見形式，其特征是β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積在特定的大腦區(qū)域，由Aβ誘導(dǎo)的Wnt信號的下調(diào)與AD的疾病進展有關(guān)。此外，越來越多的證據(jù)支持Wnt信號在胚胎發(fā)育過程中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)育以及成年大腦的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。更重要的是，通過Wnt配體持續(xù)激活Wnt信號，或抑制Wnt信號的負調(diào)節(jié)劑，例如在疾病中活躍的DKK-1和GSK-3β，能夠降低Aβ毒性并改善AD的認知能力[21]。因此，Wnt信號通路抑制劑DKK-1也可能通過影響神經(jīng)干細胞的再生，引起氟中毒所致的認知功能障礙。本實驗發(fā)現(xiàn)，NaF會影響細胞的活性，降低其增殖能力，并且隨著NaF干預(yù)時間的增加，DKK-1蛋白的表達水平也隨之增高。此外，DKK-1還與細胞凋亡之間存在密切聯(lián)系，通過阻斷Wnt /β-catenin途徑能夠促進Eca109細胞的凋亡[22]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，DKK-1表達的降低，使得Wnt /β-catenin信號通路激活，進而促進成骨細胞增殖。反之，DKK-1的異位表達可抑制細胞增殖，或通過凋亡增強因子誘導(dǎo)凋亡[24]。本項研究發(fā)現(xiàn)，NaF能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活進而誘發(fā)細胞凋亡，反之，干擾DKK-1的表達后，Wnt/β-catenin信號通路重新激活，細胞凋亡減少。

綜上所述，DKK-1能促進氟化鈉導(dǎo)致的神經(jīng)細胞PC-12凋亡，其作用機制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而發(fā)揮作用。明確DKK-1在氟中毒所致認知障礙中的作用機制，將為氟中毒所致認知功能障礙的后續(xù)治療和及早干預(yù)提供新的可能策略，也能夠為今后靶向藥物的研發(fā)提供理論參考依據(jù)。