郭 琛，李麗萍，張亞娟，李 玲，德小明，劉賀榮，楊惠芳

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)病率逐年上升，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（the international diabetes federation，IDF）數(shù)據(jù)顯示，我國是全球糖尿病患者數(shù)量最多的國家[1]。作為一種內(nèi)分泌干擾物—鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)（phthalic acid esters，PAEs），又名增塑劑[2-3]，常作為添加劑添加到食品包裝材料、兒童玩具等各種材料中，其主要作用是增加材料的可塑性和柔韌性[4]。鄰苯二甲酸二（2－乙基己基）酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）的使用量約占我國PAEs總使用量的50%，是使用量最高的一種增塑劑，其次是鄰苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）[5-6]。研究表明[7-8]，PAEs有干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)環(huán)境雌激素的效應(yīng)，糖尿病雖與遺傳和生活方式有關(guān)，但環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的作用也不容忽視。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，PAEs對生殖異常、性別分化、神經(jīng)發(fā)育和腫瘤等的發(fā)生有一定的影響，近年來PAEs對胰島素抵抗、T2DM等慢性糖代謝紊亂疾病的研究成為熱點。

在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中胰島β細(xì)胞損傷和胰島素抵抗發(fā)揮著重要作用[11]，有研究[12]表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡是胰島β細(xì)胞功能受損的主要原因，而長期低劑量暴露于PAEs可誘發(fā)體內(nèi)過氧化物的聚集而引起損傷[13]。流行病學(xué)調(diào)查表明[14]，PAEs與胰島素抵抗、T2DM間有一定的相關(guān)性，但有關(guān)實驗研究相對較少，且人類在暴露過程中并非單一介質(zhì)暴露。為此本研究采用DEHP、DBP以及二者聯(lián)合染毒，觀察對大鼠胰腺組織中凋亡蛋白的影響，以探討DEHP、DBP以及二者聯(lián)合染毒對T2DM的作用及其機制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DEHP、DBP（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），玉米油（金龍魚），血糖儀、血糖試紙（艾科靈睿，中國），大鼠胰島素ELISA測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，中國），超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所，中國），Bax、Bcl-2、Caspase 9、Caspase 3兔抗大鼠一抗（Proteintech，美國），GAPDH內(nèi)參（Bioss，中國），二抗山羊抗兔（中杉金橋，中國），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Invitrogen，美國），酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國）。

1.2 實驗動物

選擇40只健康清潔級SD雌性大鼠，3周齡，體質(zhì)量50～70 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（寧）2015-0001。飼養(yǎng)房間溫度為（22±3）℃，相對濕度（60±5）%，通風(fēng)良好，24 h晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。

1.3 分組與處理

將大鼠隨機分為4組，分別為對照（玉米油）組、DEHP染毒組（1/40 LD50，750 mg·kg-1）、DBP染毒組（1/40 LD50，500 mg·kg-1）和DEHP+DBP（750+500）mg·kg-1染毒組（聯(lián)合染毒組），每組10只。將DEHP和DBP溶于玉米油，配制成所需濃度的溶液。每天根據(jù)大鼠的體質(zhì)量計算大鼠的給藥劑量，采用灌胃方式染毒，1次/d，每周5 d，連續(xù)染毒8周，之后觀察和測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠一般狀況、體質(zhì)量 于染毒期間，每周稱量大鼠體質(zhì)量1次，并觀察大鼠毛發(fā)、皮膚、精神狀態(tài)以及行為方面有無變化。

1.4.2 器官系數(shù)的測定[15]于末次染毒過夜禁食12 h后先稱大鼠體質(zhì)量，后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，心尖取血后處死，將血液樣本置于低溫離心機中離心15 min（3 500 r·min-1）后取上清，保存于-80℃待測；同時取出胰腺，將其放在生理鹽水中沖洗，在濾紙上拭干后稱量濕重。器官系數(shù)（%）=器官質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.4.3 大鼠空腹血糖、胰島素水平測定、胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）和敏感指數(shù)計算 大鼠末次染毒后禁食（不禁水）至少12 h將大鼠剪尾，用血糖儀檢測大鼠空腹血糖；采用ELISA法檢測大鼠血清空腹胰島素水平，嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)范進(jìn)行。并計算穩(wěn)態(tài)模型HOMA-IR和胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）[16]。HOMA-IR=空腹胰島素（mIU·L-1）×［空腹血糖（mmol·L-1）/22.5］。ISI=1/Ln［空腹胰島素（mU·L-1）×空腹血糖（mmol·L-1）］。

1.4.4 血清SOD活力和MDA含量測定 采用SOD、MDA試劑盒測定大鼠血清中SOD活力和MDA含量，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。

1.4.5 Western blot法測定胰腺組織中Bax、Bcl-2、Caspase 9、Caspase 3蛋白表達(dá)水平 取約100 mg胰腺組織，置于冰上加入1 mL的組織裂解液勻漿，12 000 r·min-1，4℃離心10 min取上清，BCA法測定蛋白含量，根據(jù)不同分子質(zhì)量選擇相應(yīng)濃度的SDS-PAGE凝膠，80 V穩(wěn)定電壓電泳（蛋白上樣量為60μg），轉(zhuǎn)膜條件采用0.22μm PVDF膜濕轉(zhuǎn)，5%的脫脂牛奶（TBST溶液配制）封閉1.5 h后敷上不同濃度的一抗，4℃過夜，漂洗液清洗3次，二抗（1∶2 000）封閉1.5 h，漂洗液洗滌3次后在避光的條件下曝光，掃描圖像后用Image J軟件計算各條帶的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠一般情況的影響

隨著實驗的進(jìn)行，三組染毒組大鼠被毛無光澤、個別有少量脫毛現(xiàn)象，并在灌胃過程中出現(xiàn)煩躁抵觸現(xiàn)象。

2.2 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠體質(zhì)量的影響

各組大鼠體質(zhì)量隨染毒時間的延長而增加，不同時間各組大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見圖1。

圖1 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠體質(zhì)量的影響

2.3 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠胰腺質(zhì)量及器官系數(shù)的影響

與對照組比較，DEHP、DBP單獨染毒及DEHP+DBP聯(lián)合染毒組雌性大鼠胰腺的質(zhì)量和器官系數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。

表1 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠胰腺質(zhì)量及其器官系數(shù)的影響（±s）

表1 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠胰腺質(zhì)量及其器官系數(shù)的影響（±s）

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2.4 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠空腹血糖、胰島素水平、HOMA-IR、ISI指標(biāo)的影響

染毒第8周末，各組大鼠空腹血糖差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。胰島素水平、HOMA-IR和ISI各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與對照組相比，聯(lián)合染毒組血清胰島素濃度升高，HOMA-IR增加，ISI降低（P均＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠空腹血糖、胰島素水平、HOMA-IR、ISI的比較（±s）

表2 各組大鼠空腹血糖、胰島素水平、HOMA-IR、ISI的比較（±s）

與對照組相比*P＜0.05。

組別 n 空腹血糖/（mmol·L-1） 胰島素/（mIU·L-1） HOMA-IR ISI對照組 10 4.51±0.62 38.23±12.63 8.01±2.00 -2.01±0.26 DEHP組 10 4.82±0.41 38.92±5.40 8.42±1.73 -2.11±0.20聯(lián)合染毒組 10 5.00±0.39 74.48±24.61* 16.05±5.38* -2.79±0.35*DBP組 10 4.66±0.32 38.62±19.63 8.26±4.71 -2.05±0.44 F值 1.408 5.887 6.880 6.447 P值 0.271 0.005 0.003 0.003

2.5 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠血清中SOD活力和MDA含量的影響

染毒8周后，與對照組相比，DEHP、DBP單獨染毒和聯(lián)合染毒組大鼠血清SOD活力下降、MDA含量升高（P均＜0.05），見圖2。

圖2 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對雌性大鼠血漿氧化損傷指標(biāo)的影響（n=10，±s）

2.6 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠胰腺組織中凋亡蛋白表達(dá)的影響

染毒8周后，與對照組相比，DEHP、DBP單獨染毒和聯(lián)合染毒組均使Bax、Caspase 9、Caspase 3蛋白表達(dá)水平增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax的比值下降（P均＜0.05），見圖3。

圖3 DEHP、DBP及聯(lián)合染毒對大鼠胰腺組織中凋亡蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對人類健康造成多種危害，并且多數(shù)情況以多種物質(zhì)混合的形式接觸[17]，而作為最常見的內(nèi)分泌干擾物的DEHP和DBP與代謝紊亂有關(guān)[18]。本次實驗結(jié)果表明，DEHP、DBP以及聯(lián)合染毒對雌性大鼠體質(zhì)量增長、胰腺組織的質(zhì)量和器官系數(shù)沒有影響，提示在此劑量下和染毒期間內(nèi)DEHP、DBP以及聯(lián)合染毒對雌性大鼠體質(zhì)量增長和胰腺組織無明顯作用。T2DM主要表現(xiàn)為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損。本次研究結(jié)果顯示，兩種藥物聯(lián)合染毒后，胰島素濃度、HOMA-IR增加，ISI降低，提示DEHP和DBP聯(lián)合染毒可能會引起雌性大鼠發(fā)生胰島素抵抗。研究[19]表明，在引起糖尿病的過程中起決定作用的是胰島β細(xì)胞功能受損。氧化應(yīng)激對于誘導(dǎo)β細(xì)胞功能異常至關(guān)重要。Tanaka等[20]研究表明，分離人胰島和胰島β細(xì)胞暴露于高葡萄糖濃度會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過氧化物水平升高。正常細(xì)胞內(nèi)的促氧化物和抗氧化物維持在平衡狀態(tài)，有研究[21-22]表明DEHP、DBP可打破機體內(nèi)氧化-抗氧化的平衡機制，進(jìn)而使機體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。研究[22]發(fā)現(xiàn)，DEHP和DBP可誘發(fā)機體脂質(zhì)過氧化水平增強，氧化應(yīng)激水平增高，從而對機體造成危害。本次實驗結(jié)果表明，DEHP、DBP單獨染毒與兩者藥物聯(lián)合染毒均可使SOD活力降低、MDA含量增加。

細(xì)胞凋亡是由多基因調(diào)控的，在生理或病理情況下細(xì)胞程序性死亡[23]。研究[24]表明在線粒體凋亡途徑上促凋亡蛋白（如Bax等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2等）發(fā)揮著重要作用，而Bcl-2/Bax稱為“凋亡開關(guān)”，決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)[25]。參與細(xì)胞凋亡的Caspase家族是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的特異性半胱氨酸蛋白酶，其中凋亡的啟動者是Caspase 9，凋亡的主要執(zhí)行者是Caspase 3[26]。本次實驗結(jié)果表明DEHP、DBP單獨染毒與兩者藥物聯(lián)合染毒可使Bax、Caspase 9、Caspase 3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值下降。

綜上所述，DEHP、DBP兩種藥物聯(lián)合染毒可能降低SOD活力、增加MDA的含量使胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增加，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。但此結(jié)論還需通過后續(xù)實驗進(jìn)一步的研究來加以證實。