朱玲勤，胡小輝，高媛媛，薛姝婧，李光華，

（1.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，銀川 700004；2.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學系，銀川 750004）

Keap1/Nrf2信號通路在機體抗氧化應(yīng)激過程中具有很好的保護作用，它的激活可以使機體的氧化與抗氧化系統(tǒng)保持動態(tài)平衡狀態(tài)。不僅如此，有研究表明[1-3]，Keap1/Nrf2信號通路的激活還可在機體抗腫瘤、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)系統(tǒng)保護等方面發(fā)揮重要作用。但過度的氧化應(yīng)激會使機體的抗氧化與氧化系統(tǒng)的調(diào)控失衡，致機體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，氧化應(yīng)激對機體組織細胞的損傷作用會明顯增加。

枸杞作為一種食藥兩用的傳統(tǒng)中藥，其自身具有潤肺止咳和養(yǎng)肝明目等功效。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是從枸杞子中提取的活性成分，研究[4-9]表明，LBP具有多種藥理和生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)和其他藥理作用。本課題組前期研究[10]結(jié)果表明，力竭運動會導致大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞（RTAEC）損傷增加、血管順應(yīng)性降低，而LBP對大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞損傷有一定的保護作用，但其發(fā)揮保護作用的機制如何，成為本研究的重點內(nèi)容及創(chuàng)新點。本研究旨在探討LBP是否通過增強心血管內(nèi)皮細胞中Keap1/Nrf2抗氧化應(yīng)激信號通路的表達，提高心血管內(nèi)皮的抗氧化能力，改善機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進而達到保護心血管系統(tǒng)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RTAEC購自上海賽齊生物工程有限公司；siRNA及熒光siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；LBP（純度90%，寧夏啟元藥業(yè)）；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、ELISA試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；化學發(fā)光成像儀［美國通用電氣公司（GE）］。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

應(yīng)用小干擾RNA［siRNA（50 nmol）］轉(zhuǎn)染大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞，沉默RTAEC中的Nrf2基因。

1.2.1 轉(zhuǎn)染效率的檢測 熒光標記的siRNA是檢測轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法最常用的一種方法，按照使用說明將產(chǎn)品配制成20μmol的儲存液，由于熒光易于衰減，整個過程在黑暗的環(huán)境中進行。在LP2000的協(xié)助下轉(zhuǎn)染帶有熒光標記的siRNA（50 nmol）于內(nèi)皮細胞中。具體步驟如下：（1）按照細胞傳代的方法制備單細胞懸液，全自動細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，使細胞數(shù)在1×105個/mL左右，接種到24孔板，每孔100μL，然后每孔再加400μL完全培養(yǎng)基，最后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；（2）次日按照說明書稀釋熒光siRNA原液：吸取30μL的無血清無雙抗的培養(yǎng)基，向其中加入1.25μL 20μmol siRNA原液，輕晃使其混勻；（3）復合物制備：向步驟2配制成的液體中緩慢加入3μL LP2000，輕晃，靜置15 min，目的是使其形成轉(zhuǎn)染復合物；（4）將24孔板取出，棄去培養(yǎng)液，先加入465.75μL無雙抗培養(yǎng)基，將步驟3中的復合物沿邊緣緩慢加入，輕晃放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；（5）熒光顯微鏡下觀察拍照。分為：空白對照組（RTAEC細胞不做任何處理）、陰性對照組［LP2000（LipofectamineR）（－）組，無LP2000協(xié)助，只進行熒光素Cy3標記的siRNA轉(zhuǎn)染］、陽性對照組［LP2000（＋）組，在LP2000協(xié)助下與熒光素Cy3標記的siRNA同時進行轉(zhuǎn)染］。

1.2.2 測定最佳沉默效果分組 分為5個組分別為：空白對照組（細胞不做任何處理）、siNC組（siNC在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染）、siRNA3組（siRNA3在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染）、siRNA4組（siRNA4在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染）、siRNA5組（siRNA5在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染）。

1.2.3 沉默Nrf2基因分組 （1）空白對照組：細胞不做任何處理；（2）AngⅡ組：先用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，然后用含AngⅡ（10-6mol·L-1）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h；（3）AngⅡ+LBP組：先用含LBP（3 200μg·mL-1）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，然后用含AngⅡ（10-6mol·L-1）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h；（4）siNC組：siNC在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染；（5）siNC+AngⅡ+LBP組：siNC在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染，然后用含LBP（3 200μg·mL-1）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，然后用含AngⅡ（10-6mol·L-1）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h；（6）siRNA組：siRNA在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染；（7）siRNA+AngⅡ+LBP組：siRNA在LP2000協(xié)助下轉(zhuǎn)染，用含LBP（3 200μg·mL-1）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，再用含AngⅡ（10-6mol·L-1）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h。

1.3 Western blot檢測Nrf2、P-Nrf2的蛋白表達水平

對貼壁培養(yǎng)的細胞進行PBS清洗、胰酶消化后，進行低溫高速離心，棄掉上清，加入裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度，完成定量，配制10%的SDS-PAGE，蛋白上樣進行電泳，轉(zhuǎn)膜，10%脫脂牛奶封閉1 h，PBST洗膜結(jié)束，將膜與其針對的一抗（Nrf2 1∶700）（PNrf2 1∶700）過夜，次日，復溫1～2 h，用5%脫脂牛奶配制相應(yīng)二抗［Goat AntiMouse IgG（1∶5 000）或Goat Anti-Rabbit IgG（1∶5 000）］，進行孵育1 h，PBST清洗3次，進行條帶曝光，獲取蛋白免疫印跡條帶圖，用Image J軟件進行WB灰度值量化分析計算，根據(jù)測定出的數(shù)值，以靶蛋白灰度值/管家蛋白灰度值的比值進行表示，最后應(yīng)用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

1.4 ELISA檢測GSH、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）的含量

在水合氯醛麻醉下，打開大鼠胸腔，用5 mL注射器從左心室取出3～5 mL血液以防止溶血。將樣品轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中。30 min后，樣品在4℃、5 035×g下離心。3 min后，取血清并儲存于-80℃用于后續(xù)實驗。收集細胞上清液，在4℃下以5 035×g離心3 min，并在-80℃下儲存用于測試。將標準品和樣品裝入酶板，在37℃下孵育1 h。洗滌后，將底物溶液裝入板中，于37℃下避光孵育15 min。將終止溶液裝入板中后測量450 nm處的光密度（OD）值并計算樣品濃度：用標準品及樣本OD值作圖，如設(shè)置復孔，則應(yīng)取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），OD值為橫坐標，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線（最佳方程式應(yīng)依回歸方程計算的R2值來定，以R2值越趨近于1為好）。根據(jù)樣品OD值，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.5 RT-qPCR檢測Nrf2基因表達水平

收集單層培養(yǎng)的細胞提取RNA，1 000 r·min-14℃離心5 min，棄掉上清，依次加RZ裂解液、氯仿、乙醇、去蛋白液RD、乙醇漂洗液RW，最后加入50μL無酶水，放置2～3 min后，12 000·min-14℃離心2 min。為防止降解速度過快，將提取的RNA原液在-80℃保存，備用。將原液取出制備cDNA，測定濃度及純度的測定，八連管中加樣，上機檢測；先加水，依次為Mix，最后加RNA原液；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間和溫度條件如下：37℃下15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃下5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），4℃無限循環(huán)；將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做好標記放入-80℃冰箱保存。將RT反應(yīng)液取出進行擴增，離心備用；進行引物的溶解，向八連管中加樣，先加水，依次為RT反應(yīng)液、前向引物、反向引物，最后加TB；加樣完畢，輕柔混勻后上機進行反應(yīng)，條件如下（表1）：反應(yīng)結(jié)束，第一步計算△Ct=Ct（目的）-Ct（內(nèi)參）；第二步計算△△Ct=△Ct（樣本）-△Ct（對照）；最后按照2-△△Ct計算目的基因mRNA表達水平。

表1 qPCR擴增反應(yīng)條件

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的檢測

結(jié)果顯示，帶有熒光標記的siRNA與RTAEC共同培養(yǎng)24 h后，在轉(zhuǎn)染濃度50 nmol時，內(nèi)皮細胞中帶有熒光標記的siRNA表達最高，表明后續(xù)相關(guān)轉(zhuǎn)染實驗均以此條件為標準進行。圖1暗場顯示siRNA轉(zhuǎn)染成功的細胞，在熒光顯微鏡下觀察到的帶有紅色熒光。明場顯示透光顯微鏡下的總細胞。由此可計算出轉(zhuǎn)染效率，即暗場中的紅色細胞/明場中總細胞數(shù)的百分比。計算結(jié)果表明，本次轉(zhuǎn)染實驗的轉(zhuǎn)染效率為80%以上，可以滿足并進行后續(xù)相關(guān)實驗。

圖1 轉(zhuǎn)染效率的檢測結(jié)果（×400）

2.2 Nrf2、P-Nrf2蛋白表達、磷酸化及基因表達水平

圖2結(jié)果顯示，與空白對照組比較，siRNA5組的Nrf2蛋白表達水平降低（P＜0.05），與siNC比較，siRNA5組的Nrf2蛋白表達降低（P＜0.05），且siRNA3磷酸化Nrf2（P-Nrf2）的蛋白表達水平降低（P＜0.05），siRNA5組的P-Nrf2的蛋白表達水平降低（P＜0.01）。與空白對照組比較，siRNA3組、siRNA4組及siRNA5組的Nrf2的mRNA表達均降低（P均＜0.05）。

圖2 Nrf2、P-Nrf2蛋白表達、磷酸化及基因表達水平

2.3 Nrf2沉默對RTAEC中Nrf2、P-Nrf2表達的影響

圖3結(jié)果顯示，與AngⅡ+LBP組比較，siNC+AngⅡ+LBP組的Nrf2蛋白表達水平下降（P＜0.05）。2.4 Nrf2沉默對LBP降低RTAEC上清液中GSH、MDA、T-AOC、CAT的含量的影響

圖3 siNrf2對RTAEC中Nrf2、P-Nrf2表達的影響

圖4結(jié)果顯示，與空白對照組比較，AngⅡ組CAT、T-AOC表達水平降低（P均＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+LBP組CAT、T-AOC、GSH表達水平升高（P均＜0.05）。與AngⅡ+LBP組比較，siRNA+AngⅡ+LBP組的CAT、T-AOC、GSH表達水平降低（P均＜0.01），MDA的表達水平升高（P＜0.05）。與siNC組比較，siNC+AngⅡ+LBP組MDA表達水平下降（P＜0.05），T-AOC表達水平升高（P＜0.05）。與siNC+AngⅡ+LBP組比較，siRNA+AngⅡ+LBP組GSH表達水平下降（P＜0.05）。

圖4 siNrf2對LBP降低RTAEC上清液中GSH、MDA、T-AOC、CAT含量的影響

3 討論

心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的改變，同時，也是多種心血管疾病發(fā)生與演變的開始。內(nèi)皮細胞不僅是心血管系統(tǒng)的屏障，還具有強大的內(nèi)分泌功能，參與各種生化和生物力學信號傳導，當機體在各種內(nèi)外環(huán)境不利因素的刺激下，機體會產(chǎn)生大量應(yīng)激激素及其氧化代謝產(chǎn)物，從而影響血管內(nèi)皮的形態(tài)及功能，表現(xiàn)出血管張力受損、血壓及凝血機能失衡，從而促進了血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。研究[11]表明，機體氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細胞損傷是心血管疾病發(fā)生的重要機制之一。

課題組前期研究[12]結(jié)果表明，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠血液中AngⅡ的水平顯著升高，且大鼠胸主動脈血管對去甲腎上腺素（NE）的反應(yīng)性明顯增加，而LBP有很好的干預逆轉(zhuǎn)作用。那么，LBP在上述研究中所表現(xiàn)的對心血管系統(tǒng)的保護作用是否與內(nèi)皮細胞之間存在某種密切聯(lián)系。因此，課題組前期進行了實驗研究：當機體遭受體內(nèi)外各種應(yīng)激（壓力、手術(shù)、創(chuàng)傷、疼痛、劇烈運動等）刺激時，心血管系統(tǒng)血液循環(huán)狀態(tài)會產(chǎn)生一系列變化，如血流速度加快，對心血管內(nèi)皮細胞沖擊作用增強，使其發(fā)生損傷、脫落，導致心血管系統(tǒng)的異常改變，而LBP通過提高胸主動脈內(nèi)皮細胞中的抗氧化應(yīng)激信號通路的蛋白表達水平，來增強機體內(nèi)皮抗氧化能力，進而改善心血管系統(tǒng)的抗氧化應(yīng)激狀態(tài)起到保護心血管系統(tǒng)的作用。

因此，本研究以AngⅡ制備細胞氧化應(yīng)激模型，通過沉默RNA技術(shù)降低Nrf2的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，AngⅡ組的T-AOC、CAT表達水平降低。與AngⅡ組比較，AngⅡ+LBP組GSH、CAT、T-AOC表達水平升高。與AngⅡ+LBP組比較，siRNA+AngⅡ+LBP組的GSH、CAT、T-AOC表達水平均降低，MDA的表達水平升高。表明LBP減輕機體內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)可能是通過增強Nrf2蛋白表達水平來實現(xiàn)的。

綜上所述，本課題通過前期的體內(nèi)實驗表明，LBP對抗應(yīng)激狀態(tài)、保護心血管機能是通過改善內(nèi)皮細胞的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中Keap1/Nrf2的抗氧化應(yīng)激蛋白表達水平來實現(xiàn)的，以及本次研究中的體外細胞實驗的結(jié)果表明，LBP對抗AngⅡ所產(chǎn)生的應(yīng)激狀態(tài)，很可能是通過提高抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中的Nrf2蛋白表達水平來實現(xiàn)的，進而提高內(nèi)皮細胞的抗氧化應(yīng)激的能力，緩解機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)和血管心肌的損傷，最終起到保護心血管系統(tǒng)的功能，相關(guān)機制的明確還需今后在蛋白、分子水平進一步探討。