葛愛娟，王小紅，葉 紅

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第904醫(yī)院婦產(chǎn)科，無錫 214000）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，并在世界范圍內(nèi)明顯上升[1]。據(jù)統(tǒng)計[2]，全球每年約有46.6萬宮頸癌新發(fā)病例。我國每年估計新發(fā)宮頸癌病例13.5萬，約占全世界新發(fā)人數(shù)的28.7%。因此，早發(fā)現(xiàn)早治療尤為重要。微小RNA（microRNAs，miRNA）是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼RNA分子，能通過與靶基因的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達[3]。越來越多的證據(jù)[4-5]表明，miRNA在腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用。miR-612是一類位于11號染色體上的miRNA，并在幾種人類癌癥中存在異常表達[6-8]，如膀胱癌、肝癌、胃癌等。然而，miR-612在宮頸癌中的作用尚未報道。為此本文研究了miR-612在體外對宮頸癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響，以此為臨床早期診治宮頸癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人宮頸癌SiHa細胞系（上海通派生物科技有限公司）；氯仿、異丙醇、乙醇（上海化學(xué)試劑有限公司）；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑、cDNA Reverse Transcription kit、RNAiso plus（D9108A）Trizol（大連寶生物Takara公司）；DMEM培養(yǎng)基（上海索萊寶生物科技有限公司）；青鏈霉素、胎牛血清、DMSO、0.25%胰酶消化液（美國Gibco公司）；Lipofectamine2000［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；miR-612 mimic、miR-612 minic-NC（廣州市銳博生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司）；PI染液、Matrigel（美國BD公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）；結(jié)晶紫（美國Sigma公司）。

1.2 主要儀器

高速低溫離心機（德國Eppendorf公司）、ABI7500 PCR儀器（美國Applied Biosystems公司）、PCR擴增儀（美國Life Technologies公司）、超凈工作臺（新加坡Esco公司）、二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron Corporation公司）、SpectraMax M5酶標儀（美國Molecular Device公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉(zhuǎn)染與分組 將宮頸癌SiHa細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM液中，置于37℃、5%CO2的恒溫箱中，當(dāng)細胞增殖到80%匯合度時進行傳代。用Lipofectamine2000分別將miR-612模擬物、miR-612 NC轉(zhuǎn)染至SiHa細胞，并分為miR-612 mimic組（轉(zhuǎn)染miR-612模擬物，5 nmol）、miR-612 mimic-NC組（轉(zhuǎn)染miR-612 NC，5 nmol）和空白對照組（不做任何處理），操作步驟嚴格按照Lipofectamine2000說明書進行。

1.3.2 qRT-PCR法檢測各組SiHa細胞miR-612的表達水平 使用Trizol試劑分別從各組SiHa細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。miR-612以U6作為內(nèi)參。采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法檢測各組SiHa細胞中miR-612的表達水平。擴增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。PCR引物序列：miR-612正義：5'-GCAGGGCTTCTGAGCTCCTTAA-3'，反義：5'-CAAATTCGTGAA GCGTTCCATAT-3'；U6正義：5'-TGCGGGTGCT CGCTTCGCAGC-3'，反義：5'-CCAGTGCAGGGTC CGAGGT-3'。PCR擴增完畢后進行熔解曲線分析，根據(jù)內(nèi)參，按公式（2-△△Ct法）計算目的基因miR-612的表達水平，每次操作設(shè)立3個復(fù)孔并取平均值。

1.3.3 CCK-8法檢測各組SiHa細胞的增殖情況 將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞消化接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)液總體積100μL（3 000 cells），置于37℃、CO2培養(yǎng)箱，待其貼壁，更換培養(yǎng)基，每孔加入混有10%CCK-8檢測試劑的培養(yǎng)液，37℃孵育1 h。從培養(yǎng)箱取出并于避光條件下在450 nm處檢測吸光度，判斷第24、48、72及96 h時細胞的增殖情況，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測各組SiHa細胞的細胞周期 采用適量的胰酶消化、收集轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌SiHa細胞，以2 000 r·min-1離心5 min，磷酸緩沖液（PBS）清洗2次，收集并置于預(yù)冷的70%乙醇，于4℃下固定過夜。后于2 000 r·min-1速度離心15 min收集固定細胞，用100μL PBS重懸細胞并轉(zhuǎn)至試管中輕輕吹打（防止細胞破碎）。加50μL PI染液和2μL核糖糖酸酶（RNase）于室溫放置15 min。流式細胞儀檢測各組SiHa細胞周期變化，應(yīng)用ModFit LT軟件分析結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

1.3.5 細胞劃痕實驗檢測各組SiHa細胞的遷移能力 在培養(yǎng)于6孔板上的轉(zhuǎn)染后48 h的各組SiHa細胞上做劃痕實驗，用1μL槍頭在6孔板上均勻劃痕，用PBS洗滌3次，加入DMEM；置于37℃、5%CO2的恒溫箱中進行培養(yǎng)。于0 h和24 h時在顯微鏡下取點，觀察并拍照。以劃痕兩側(cè)細胞間的距離為劃痕寬度，計算相對劃痕寬度，相對劃痕寬度=24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度。實驗重復(fù)3次。

1.3.6 Transwell檢測各組細胞的侵襲能力 收集轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌SiHa細胞，將稀釋好的Matrigel膠100μL小心垂直加入預(yù)冷的8μm聚碳酯膜的Transwell小室（冰上操作），置于37℃培養(yǎng)30 min。取0.2 mL細胞懸液接種于Transwell小室上層，下層注入0.5 mL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃孵箱孵育24 h。將膜下層細胞同1%多聚甲醛混合，用0.2%結(jié)晶紫溶液染色15 min，倒去染液，PBS清洗5 min×3次，于鏡下觀察拍照，隨機選取6個視野計數(shù)后取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-612在各組SiHa細胞中的表達情況

與miR-612 mimic-NC組和空白對照組比較，miR-612 mimic組miR-612表達水平增高（P均＜0.05），見圖1，提示轉(zhuǎn)染成功。

圖1 qRT-PCR檢測miR-612在各組SiHa細胞中的表達情況

2.2 過表達miR-612對SiHa細胞增殖的影響

與miR-612 mimic-NC組和空白對照組比較，miR-612 mimic組細胞的增殖能力受到明顯抑制（P均＜0.05），見圖2。

圖2 CCK-8法檢測各組SiHa細胞的增殖情況

2.3 過表達miR-612對SiHa細胞周期的影響

轉(zhuǎn)染miR-612模擬物后，miR-612 mimic組處于G0/G1期細胞的比例高于miR-612 mimic-NC組和空白對照組（P均＜0.05）；miR-612 mimic組處于S期細胞的比例低于miR-612 mimic-NC組和空白對照組（P均＜0.05）；miR-612 mimic組處于G2/M期細胞的比例與miR-612 mimic-NC組和空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見圖3。提示miR-612過表達增加了SiHa細胞G0/G1期的比例，減少了細胞S期的比例。

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組SiHa細胞的細胞周期

2.4 過表達miR-612對SiHa細胞遷移的影響

各組細胞于轉(zhuǎn)染48 h后行細胞劃痕試驗，與miR-612 mimic-NC組和空白對照組比較，miR-612 mimic組細胞的遷移愈合距離受到明顯抑制（P均＜0.05），見圖4。

圖4 各組SiHa細胞24 h后劃痕愈合情況

2.5 過表達miR-612對SiHa細胞侵襲的影響

miR-612 mimic組侵出小室的細胞數(shù)較miR-612 mimic-NC組和空白對照組均降低（P均＜0.05），見圖5。提示過表達miR-612能抑制SiHa細胞的侵襲能力。

圖5 Transwell檢測各組SiHa細胞侵襲能力

3 討論

宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的、多步驟、多基因參與的過程[9]。盡管目前臨床擁有化療、放療、手術(shù)治療等多種有效方法治療宮頸癌，但宮頸癌患者的病死率仍居高不下，最主要的原因就是宮頸癌細胞發(fā)生了侵襲與轉(zhuǎn)移[10]。故尋找抗腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的新療法已成為當(dāng)前熱點及難點問題。在人類基因組中存在超過1 000多個miRNAs，每一個都可能調(diào)控數(shù)百個信使RNA（mRNA）。越來越多的證據(jù)[11-12]表明，miRNAs在大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)病機制中具有致癌或抑癌功能，其中許多與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

本研究的miR-612定位于11號染色體上，在不同腫瘤類型中表現(xiàn)出不同的表達水平。Sheng等[13]研究表明，miR-612在結(jié)直腸癌組織及細胞中表達下調(diào)，這與miR-612直接抑制蛋白激酶B2（AKT2），進而抑制下游上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)信號通路有關(guān)。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-612在食管鱗癌組織及細胞中高表達，可能通過調(diào)控腫瘤抑制蛋白P53（TP53）的表達來影響食管鱗癌細胞的遷移及侵襲。本實驗采用Lipofectamine2000分別將miR-612模擬物、miR-612 NC轉(zhuǎn)染至人宮頸癌SiHa細胞，并采用SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測各組SiHa細胞miR-612的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-612 mimic組miR-612表達水平高于miR-612 mimic-NC組和空白對照組，提示本研究成功建立miR-612過表達SiHa細胞模型。進而，采用CCK-8法檢測了各組SiHa細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)與miR-612 mimic-NC組和空白對照組比較，miR-612 mimic組各時段的增殖均受到抑制，提示過表達miR-612可抑制SiHa細胞的增殖。采用流式細胞術(shù)檢測miR-612模擬物處理后的SiHa細胞，發(fā)現(xiàn)其G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例降低。推測miR-612過表達可能通過使SiHa細胞持續(xù)處于G0/G1期來抑制其增殖。采用細胞劃痕實驗以及Transwell實驗分別檢測各組SiHa細胞的遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)miR-612 mimic組的遷移和侵襲能力均較miR-612 mimic-NC組和空白對照組降低，提示過表達miR-612會抑制SiHa細胞的遷移和侵襲。

綜上，過表達miR-612能使宮頸癌SiHa細胞的增殖活性降低、使G0/G1期的細胞比例增加、抑制SiHa細胞的遷移和侵襲。此后，以miR-612作用于宮頸癌的機制作為重點研究方向，從而為宮頸癌的早期診治及判斷miR-612如何參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展提供更為有力的科學(xué)依據(jù)。